抗凝血酶Ⅲ对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

张平安， 祁亚斌 (西安市红十字会医院中医骨科， 西安 70054;西安市第九医院普外二科;通讯作者，E-mail:qiyabin975@63.com)

抗凝血酶Ⅲ对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

张平安1， 祁亚斌2*(1西安市红十字会医院中医骨科， 西安 710054;2西安市第九医院普外二科;*通讯作者，E-mail:qiyabin1975@163.com)

目的 研究抗凝血酶Ⅲ对大鼠继发性脊髓损伤的保护作用及其机制。 方法 SD大鼠36只，随机分为假手术组、损伤组、治疗组(n=12)。采用Allen’s撞击法建立脊髓损伤模型，假手术组仅咬除椎板，不损伤脊髓。治疗组在脊髓损伤后15 min腹腔注射抗凝血酶Ⅲ250 IU/kg。术后24 h取脊髓组织测定髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);24 h、1周、2周、3周行斜板试验和BBB评分。 结果 损伤组较假手术组MPO、MDA升高，SOD降低(P＜0.01);治疗组较损伤组MPO、MDA降低，SOD升高(P＜0.01)，且行为学评分佳(P＜0.05)。 结论 抗凝血酶Ⅲ对大鼠脊髓继发性损伤有保护作用，其机制与抑制中性粒细胞介导的免疫炎症反应有关。

脊髓损伤; 中性粒细胞; 髓过氧化物酶; 抗凝血酶Ⅲ

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后引起继发性脊髓损伤，进一步加重神经功能障碍，其病理生理过程复杂，病理机制尚不完全清楚，中性粒细胞介导的免疫炎症反应是一个重要机制［1，2］。近年研究证实较大剂量的抗凝血酶Ⅲ能促进前列环素(PGI2)的生成，从而抑制中性粒细胞活性增高所致的免疫炎症反应。本实验通过对大鼠脊髓损伤后腹腔注射抗凝血酶Ⅲ，研究其对继发性脊髓损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 普通级SD大鼠，体重280－320 g，雌雄不限，由东南大学医学院实验动物中心提供，随机分3组，每组各12只。假手术组:仅咬除椎板，不损伤脊髓。损伤组:造模后15 min给大鼠腹腔注射生理盐水2 ml。治疗组:造模同损伤组，伤后15 min给大鼠腹腔注射抗凝血酶Ⅲ250 IU/kg。各组分别于手术后24 h随机处死6只，取脊髓组织测定髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);剩余6只于24 h、1周、2周、3周行斜板试验和BBB评分。

1.2 动物造模 采用Allen’s撞击法建立脊髓损伤模型。以戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉，取背部正中切口，咬除胸10棘突和椎板，暴露硬膜，取重10 g、直径2.5 mm的金属棒从2.5 cm高度沿玻璃管垂直自由落下，砸伤胸10节段脊髓，造成大鼠不全性截瘫。造模成功的标志是:撞击的脊髓组织充血水肿，双下肢及身体回缩，尾巴痉挛摆动。然后缝合切口。

1.3 MPO、SOD、MDA测定 戊巴比妥钠麻醉后，大出血处死，以手术区为中心，取脊髓组织长约1.5 cm，制备组织匀浆，按 MPO、SOD、MDA测试盒(南京建成生物工程研究所)说明检测。

1.4 斜板试验 将大鼠纵轴与斜板纵轴一致，斜板每次升高5度，记录大鼠能停留5 s的最大夹角。

1.5 BBB评分 将动物置于直径2 m的平面光滑场地自由活动，观察后肢的关节活动、步态等运动功能4 min，由熟悉该评分系统的非本实验人员进行盲法评分。第一步(0－7分)评判动物后肢各关节活动;第二步(8－13分)评判动物后肢的步态和协调功能;第三步(14－21分)评判动物运动中爪的精细动作，三项满分 21 分［3］。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行数据分析，所有参数以±s表示，组内比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓组织 MPO、SOD、MDA测定 损伤组中MPO、MDA水平较假手术组明显升高，SOD水平明显(P＜0.01，见表1)。而治疗组的MPO、MDA较损伤组明显降低，SOD水平明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.01，见表1)。

表1 伤后24 h脊髓组织中MPO、SOD、MDA的含量(n=6±s)Tab 1 The results of MPO，SOD，MDA activities in injuried spinal cord at 24 h after injury(n=6，±s)

表1 伤后24 h脊髓组织中MPO、SOD、MDA的含量(n=6±s)Tab 1 The results of MPO，SOD，MDA activities in injuried spinal cord at 24 h after injury(n=6，±s)

与假手术组比较，*P ＜0.01;与损伤组比较，#P ＜0.01

组别 MPO/(U/g组织)SOD/(U/mg蛋白)MDA/(nmol/mg蛋白)假手术组1.826 ±0.087 226.2 ±13.8 19.38 ±1.42损伤组 3.108 ±0.164* 130.5 ±10.3* 42.88 ±2.40*治疗组 2.494 ±0.086# 184.2 ±9.4# 27.39 ±2.16#

2.2 行为学评估 损伤组斜板试验和BBB评分在术后24 h、1周、2周、3周均明显差于假手术组，而治疗组斜板试验和BBB评分在术后24 h、1周、2周、3周均明显优于损伤组，而且差异均有统计学意义(P＜0.05，见表 2，3)。从术后 24 h至术后3 周动物的行为学评估逐渐好转，治疗组在术后3周已接近于正常，斜板试验评价与假手术组间的差异无统计学意义(P＞0.05)，但BBB评分仍有统计学差异(P＜0.05)，见表2，3。

表2三组大鼠伤后斜板试验结果(度，n=6，±s)Tab 2The results of inclined-plane test in rats(degrees，n=6，±s)

表2三组大鼠伤后斜板试验结果(度，n=6，±s)Tab 2The results of inclined-plane test in rats(degrees，n=6，±s)

与假手术组比较，*P ＜0.01;与损伤组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 术后24 h 术后1周 术后2周 术后3周假手术组 57.50 ±5.24 59.37 ±3.16 58.33 ±4.08 60.00 ±4.47损伤组 32.50 ±2.74* 39.17 ±3.76* 40.00 ±3.16* 49.17 ±3.76*治疗组 36.67 ±2.58*# 49.17 ±8.04*## 50.00 ±4.47*## 58.33 ±4.08##

表3三组大鼠伤后BBB评分结果(分，n=6，±s)Tab 3The results of BBB scales in rats(scores，n=6，±s)

表3三组大鼠伤后BBB评分结果(分，n=6，±s)Tab 3The results of BBB scales in rats(scores，n=6，±s)

与假手术组比较，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05;与损伤组比较，△P＜0.01

组别 术后24 h 术后1周 术后2周 术后3周假手术组21 21 21 21损伤组 2.83 ±0.75* 7.67 ±0.82* 10.17 ±1.17* 13.17 ±0.98*治疗组 6.33 ±0.82＊△ 10.83 ±0.98＊△ 13.17 ±0.75＊△ 18.50 ±1.05＊＊△

3 讨论

脊髓损伤后，TNF-α、IL-1、IL-6等促炎症反应因子增多，使中性粒细胞黏附于内皮细胞，两者相互作用，内皮细胞损伤，通透性增加，中性粒细胞活化，浸润到局部组织，释放弹性蛋白酶、氧自由基等多种炎症介质，自由基能结合细胞膜的多不饱和脂肪酸，从而启动脂质过氧化反应，引起继发性脊髓损伤［4，5］。MPO活性的高低代表中性粒细胞的数量和活性，MDA是脂质过氧化的基本代解产物，其水平的检测常作为脂质过氧化指标。故而脊髓损伤后MPO、MDA升高。SOD是超氧阴离子清除剂，机体为了清除过多的自由基，必然消耗大量的SOD，引起SOD下降。

抗凝血酶Ⅲ是一种α2－球蛋白，是凝血酶和其他丝氨酸蛋白酶的生理性抑制剂，其抗凝作用人们熟知，已成功用于弥散性血管内凝血的治疗。近年研究［6，7］证实，较大剂量的抗凝血酶Ⅲ能促进血管内皮细胞释放前列环素，而前列环素能抑制促炎症反应介质，保护血管内皮细胞，阻断活化的中性粒细胞与内皮细胞黏附，并能够抑制活性氧和中性粒细胞弹性蛋白酶的释放，从而抑制中性粒细胞活性增高所致的免疫炎症反应。故而理论上抗凝血酶Ⅲ应该对脊髓损伤有良好的治疗作用。

本实验中，脊髓损伤后应用抗凝血酶Ⅲ治疗较未治疗者，组织中MPO、MDA明显降低，SOD明显升高，说明抗凝血酶Ⅲ可能通过促进血管内皮细胞释放前列环素，从而抑制中性粒细胞活化，减轻炎症反应，减少氧自由基的产生，缓解SOD的消耗，同时脂质过氧化反应减轻，MDA等产物减少。

在大鼠的行为学评估中，脊髓损伤后24 h、1周、2周、3周斜板试验和BBB评分均显示抗凝血酶Ⅲ治疗组明显优于损伤组，且功能恢复更快。这进一步证实抗凝血酶Ⅲ对大鼠继发性脊髓损伤有保护作用，也说明中性粒细胞在继发性脊髓损伤的病理机制中发挥重要作用，可通过抑制其活性，减轻免疫炎症反应，减少继发性损伤，从而改善功能恢复。Arai等［8］在大鼠脊髓损伤前应用抗凝血酶Ⅲ，发现治疗组的运动功能、脊髓诱发电位、组织学改变均明显优于损伤组。

综上所述，抗凝血酶Ⅲ对大鼠脊髓继发性损伤有保护作用，其机制与抑制中性粒细胞介导的免疫炎症反应有关。

［1］ Beck KD，Nguyen HX，Galvan MD，et al.Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury:evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment［J］.Brain，2010，133(Pt2):433 －447.

［2］ 祁亚斌，吴小涛，付文芹，等.大鼠不同程度脊髓损伤后的中性粒细胞活性［J］.中国临床康复，2006，10(28):91 －93.

［3］ Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12(1):1 －21.

［4］ Yang L，Blumbergs PC，Jones NR，et al.Early expression and cellular localization of proinflammatory cytokines interleukin-1［beta］，interleukin-6，and tumor necrosis factor-［alpha］ in human traumatic spinal cord injury［J］.Spine，2004，29(9):966 －971.

［5］ Ghasemlou N，Bouhy D，Yang J，et al.Beneficial effects of secretory leukocyte protease inhibitor after spinal cord injury［J］.Brain，2010，133(1):126 －138.

［6］ Okajima K，Uchiba M.The anti-inflammatory properties of antithrombin Ⅲ:New therapeutic implications［J］.Semin Thromb Hemost，1998，24(1):27 －32.

［7］ Taoka Y，Okajima K，Uchiba M.Antithrombin reduces compression-induced spinal cord injury in rats［J］.J Neurotrauma，2004，21(12):1818－1830.

［8］ Arai M，Goto T，Seichi A，et al.Effects of antithrombinⅢ on spinal cord-evoked potentials and functional recovery after spinal cord injury in rats［J］.Spine，2004，29(4):405 －412.

Protective effects of antithrombinⅢon experimentally secondary spinal cord injury in rats

ZHANG Ping-an1，QI Ya-bin2*(1Dept of Traditional Chinese Medicine Orthopedics，Xi’an Red Cross Hospital，Xi’an 710054，China;2Second Dept of General Surgery，Ninth Hospital of Xi’an;*Corresponding author，E-mail:qiyabin1975@163.com)

ObjectiveTo investigate the protective effects of antithrombinⅢ(ATⅢ)on experimentally secondary injury of spinal cord in rats and its mechanism.MethodsThirty-six Sprague-Dawleys rats were randomly divided into three groups:sham group(n=12)，spinal cord injury(SCI)group(n=12)，ATⅢ treatment group(n=12).Only vertebral lamina excision was performed without SCI in sham group.In the other two groups，the SCI rat models were established according to Allen’s method.Fifteen minutes after SCI，rats in treatment group were intraperitoneally injected with ATⅢ(250 IU/kg)，while those in control group were given normal sodium.The myeloperoxidase(MPO)and superoxide dismutase(SOD)activities and malondialdehyde(MDA)level in spinal tissues were measured at 24 h after operation.Function of nerves was assessed by inclined-plane test and BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)scales at 24 h and at 1，2，3 week after operation respectively.ResultsCompared with sham group，the MPO activity and the level of MDA in control group significantly increased(P＜0.01)，and the SOD activity reduced(P＜0.01).Compared with control group，MPO activity and the level of MDA in treatment group decreased and SOD activity increased significantly(P＜0.01).Behavioral score in treatment group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).ConclusionATⅢ has neuroprotective effects on secondary spinal cord injury，which might be associated with the inhibition of neutrophils-mediated immune inflammatory reaction.

spinal cord injury;neutrophils;myeloperoxdase;antithrombinⅢ

R651.2

A

1007 －6611(2011)01 －0015 －03

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.004

张平安，男，1955－03生，本科，副主任医师，E-mail:435342755@qq.com.

2010－11－15］