一株铜绿假单胞菌新型整合子检测与分析

孙光明，朱桂芳，常月琴

(江苏大学附属第四人民医院检验科，江苏 镇江 212001)

一株铜绿假单胞菌新型整合子检测与分析

孙光明，朱桂芳，常月琴

(江苏大学附属第四人民医院检验科，江苏 镇江 212001)

目的了解临床分离铜绿假单胞菌PA 091701整合子携带耐药基因情况，探讨新的基因盒排列与多重耐药关系。方法药物敏感试验采用K-B纸片扩散方法，整合子及耐药基因盒的检测采用PCR方法。结果在所测试抗菌药物中，PA091701表现对多粘菌素敏感，对亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦中介，对其它种类抗菌药物耐药；基因盒检测结果显示，PA091701所携带aac(6’)II、aadA13和oxA10a基因盒为首次出现新的基因盒排列方式，并已登录Gen Bank：JN118546。结论PA091701携带的基因盒与其对氨基糖苷类、β-内酰胺类耐药有关，表明其多重耐药性除整合子外，还存在其它耐药机制。

铜绿假单胞菌；整合子；耐药

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA)是引起医院内感染的重要条件致病菌。由于抗菌药物的广泛使用，PA的耐药性逐渐增加，导致临床抗感染治疗的失败。PA耐药机制包括菌体固有耐药机制和获得性耐药机制。近年来研究结果表明，通过耐药基因水平转移而获取外界耐药基因是引起PA迅速形成耐药的主要原因，而整合子被认为与这一形成过程密切相关[1，2]。整合子是一耐药基因捕获并表达元件，目前已经出现4种耐药相关整合子类型，其中I类整合子分布最为广泛，与临床耐药关系也最为密切[3]。本研究通过对本地区PA的整合子进行检测，发现I类整合子新的耐药基因盒排列形式，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌株PA091701来自我院ICU病房一住院病人呼吸道感染患者痰标本，菌株的鉴定采用法国梅里埃公司API板条。

1.2 药物敏感试验

药物敏感试验采用K-B纸片法，结果判读参照2009年CLSI标准，测试药物包括哌拉西林、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、多粘菌素。药敏纸片均购自美国BD公司。质控菌株采用大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 I类整合子及整合子可变区PCR检测

细菌模板提取采用煮沸方法。整合子及可变区基因引物设计参照已知文献[4]，引物由英骏公司合成。intI1上游引物 5′-ACATGTGATGGCGACGCACGA-3′，下游引物 5′-ATTTCTGTCCTGGCTGGC-3′；整合子可变区上游引物 5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′， 下 游 引 物 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′。I类整合子基因检测PCR反应 体 系 设 50μl， 其 中 10 ×PCR Buffer 5.0μl，dNTP4.0μl，引物各 1μl，模板 2μl，Taq 酶 1μl，加蒸馏水至50μl。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火 30s，72℃延伸 1min，反应 30个循环，最后72℃延伸7min。整合子可变区扩增采用长链高保真 PCR(大连宝生)，反应体系 50μl，其中 10×PCR Buffer 5.0μl，dNTP 4.0μl， 引 物 各 1μl，酶0.25μl。反应参数为：94℃预变性 5min，94℃变性1min，55℃退火 1min，72℃延伸 4min，反应 35个循环，最后72℃延伸7min。

1.4 PCR产物纯化、克隆及测序

纯化后的PCR产物连接PMD18-T载体，转化至CaCl2制备的大肠埃希菌DH5α感受态细胞，经氨苄西林(100mg/L)的LB培养基进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落涂布平板，菌落PCR筛选阳性克隆，阳性克隆菌株提取质粒送上海英骏公司进行双向测序。

1.5 数据处理

测序拼接结果在Gen Bank进行比对分析，确定整合子类型，并详细分析整合子可变区详细基因序列。

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌耐药表型分析

PA091701菌株药敏结果仅显示对多粘菌素敏感，对亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦中介，对其它测试药物均耐药。

2.2 整合子及可变区基因检测分析

PA091701采用I类整合子检测结果显示其携带I类整合子基因(图1)，为了方便有效的扩增并测序可变区的基因序列，采用长链高保真PCR，结果显示约3000bp出现一阳性条带(图2)，经克隆测序的序列结果比对分析，基因盒排列为aac(6’)II、aadA13、oxA10a，为一新的耐药基因盒排列形式。该基因序列已登录Gen Bank，基因号：JN118546。

3 讨论

近年来随着侵入诊治技术的不断增多，免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛使用，非发酵菌属PA分离率有明显增高趋势，与此同时，该菌的耐药率也不断攀升[5]。本实验所报道的PA菌株为一临床高度耐药菌株，仅表现了对多粘菌素的敏感，对其它种类抗生素包括碳青霉烯类耐药或中介，应引起我院足够重视。

图1 I类整合子PCR扩检测结果图：M为DNA2000maker，从上到下 2000、1500、1000、750、500、250；1、2、3、4、5 为 I类整合子基因扩增阳性标本。

图2 I类整合子可变区PCR扩检测结果图：M为DNA10000maker，图中亮带从上到下分别显示显示6000、3000和1000bp条带；1为I类整合子可变区基因扩增阳性标本。

耐药基因通过一些可以移动的基因元件如整合子、转座子及质粒在菌株之间水平转移，导致细菌耐药的迅速出现及传播，已成为世界范围内所关注的严重的问题。整合子是一基因捕获并表达元件，是由Stokes于1989年首次提出，被认为与细菌水平转移耐药基因密切相关。典型的整合子结构是由保守区和可变区两部分组成。保守区域即整合酶活性区域，具有整合和切除耐药基因功能；可变区是由一系列串联排列的耐药基因盒组成[6]。整合子本身不可以移动，但是其常位于可移动基因成分如转座子和质粒上，从而介导耐药基因水平转移[7]。

本实验通过对整合子可变区扩增、测序和比对分析发现了一个新的整合子排列形式。该整合子携带 aac(6’)II、aadA13和 oxA10a耐药基因，其中 aac(6’)II和aadA13分别编码氨基糖苷类乙酰转移酶，表现对氨基糖苷类耐药，oxA10a编码β-内酰胺酶，表现对β-内酰胺类药物耐药。耐药表型结果与PA091701整合子所携带耐药基因相一致，但是耐药表型显示的氯霉素及左氧氟沙星的耐药，整合子并没有携带相关基因，提示铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，除整合子外还存在其它耐药机制[8]。值得注意的是，虽然本实验首次报道了aac(6’)II、aadA13和oxA10a基因盒组合形式，但是这些相应耐药基因盒早已经在革兰阴性杆菌中广泛分布；此外，国内南京地区曾首次在铜绿假单胞菌报道了 aac(6’)II、aadA13、clmA8 及 oxA10a基因盒排列形式[9]，而本次镇江地区报道基因盒排列比南京地区报道的基因盒排列缺少一clmA8基因，形成这一原因具体机制并不十分清楚，推测认为这一现象可能与在抗生素选择压力下整合子可以不断地整合或切除耐药基因以使菌株更容易适应环境有关。

[1]Hall RM.Mobile gene cassettes and integrons moving antibiotic resistance genes in gram-negative bacteria [J].Ciba Found Symp,1997,207:192-202.

[2]Rowe-Magnus DA,Guerout AM,Mazel D.Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes[J].Mol Microbiol,2002,43(6):1657-1612.

[3]顾 兵,童明庆.整合子与细菌耐药[J].临床检验杂志,2005,23(3):83-86.

[4]Barlow RS,Pemberton JM,Desmarchelier PM,et al.Isolation and characterization of integron-containing bacteria without antibiotic selection[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48:838–842.

[5]Wang CY,Jerng KY,Chen LN,et al.Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalized patients: clinical features,risk-factors and outcomes[J].Clin Microbiol Infect,2006,12:63-68.

[6]唐吉斌,宋有良.整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究进展[J].医学综述,2009,15(7):984-987.

[7]蔡 挺,张 顺,陈 琳,等.鲍氏不动杆菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记及菌株亲缘性研究 [J].中华医院感染学杂志,2007,17(10):1181-1184.

[8]许宏涛,张秀珍.医院感染铜绿假单胞菌多重耐药机制的研究[J].中国抗感染化疗杂志,2005,5(3):141-145.

[9]Yuan W,Hui L,Jun L,et al.Detection of Pseudomonas aeruginosa carried a new gene cassette array within class I integron isolated from a teaching hospital in Nanjing,china[J].J Microbiol,2008,46(6):687-691.

Detection and analysis of novel gene cassette array in one clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa

SUN Guangming,ZHU Guifang,CHANG Yueqin.Department of Clinical Laboratory,The Fourth Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212001,China

Objective To investigate the presence of resistant integron containing gene casstte arrays of Pseudomonas aeruginosa PA091701 and its association with multi-drug resistance.Methodes Susceptibility to antibiotics was determined by disk diffusion method and the presence of integron containing gene cassettes was tested by PCR.ResultsAmong the tested antibiotics,PA091701 was sensitive to polymyxin,intermediated susceptibility to imipenem and piperacillin/tazobactam,and resistance to other antibiotics.Sequence analysis of gene cassette array revealed the presence of novel gene cassette array containing aac(6＇)II,aadA13 and oxA-10a genes in PA091701,and logged in GenBank:JN118546.Conclusions The muti-drug resistance of PA091701 may be related to the gene cassettes haboured in integron,and it also involved other resistance mechanisms except integron.

Pseudomonas aeruginosa；Integron；Resistance

R378.99+1,R446.5

A

1674-1129(2011)05-0489-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.05.010

江苏省镇江市社会发展规划，编号：2010041

孙光明，1975年出生，主管检验技师，2006年安徽医科大学临床检验诊断学硕士毕业，2010就读于江苏大学临床检验诊断学专业博士学位，研究方向为细菌耐药。