1株产聚-β-羟基丁酸芽胞杆菌的分离、筛选与鉴定

董夏梦,宋迤明,蒋冬花,蓝丽精,蔡琪敏

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

聚-β-羟基丁酸(PHB)是微生物在营养不均衡条件下(如碳源过剩、氮、磷、硫等营养限制)积累在体内作为其营养和能量储存物质的天然高分子储存物(分子量50 000～1 000 000)。PHB首先由法国巴斯德研究所M.Lemoigne于1926年从巨大芽胞杆菌(Bacillus m egatherium)中分离鉴定,其在物理性质甚至分子结构上都与聚丙烯很相似,作为一种天然高分子聚合物,它还具有生物可降解性、生物相容性、低透氧性、无刺激性、光学活性等特殊性能[1]。作为无公害塑料,PHB吸引了广泛的关注。目前国内外所用PHB生产菌种中以真养产碱杆菌研究及应用最为广泛[2]。真核生物中尚未发现有PHB颗粒存在[3],而原核生物中,革兰阳性菌或阴性菌均发现PHB产生菌,例如:产碱杆菌属、固氮菌属、假单胞菌属、生丝微菌属、嗜盐杆菌属和甲基杆菌属等[4]。本研究从土壤中分离筛选到1株产PHB较高的芽胞杆菌PX-95,根据形态特征、生理生化特征以及分子技术将其鉴定为苏云金芽胞杆菌(B acillus thuringiensis)。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 芽胞杆菌菌株分离筛选自浙江省各地(杭州、宁波、温州、绍兴、金华、台州、丽水)采集的土样,包括玉米地、番薯地、花生地等土壤。1.1.2 培养基(g/L) ①牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,琼脂20,pH 7～7.2,用于菌种分离;②种子培养基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7～7.2;③发酵培养基[5]:蔗糖10,牛肉膏5,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl20.05,FeCl30.01,K2HPO40.04,KH2PO40.03,NaH2PO4·2H2O 0.05,H3BO30.005,pH 7.8。

1.1.3 主要试剂 聚-β-羟基丁酸(PHB)标准品购自Sigma公司,苏丹黑购自上海生工生物工程有限公司,其他试剂均为国产生化试剂或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 高产PHB芽胞杆菌的分离、筛选 ①芽胞杆菌的分离、纯化:取土样1.0 g,加9 mL无菌水稀释,80℃水浴15 min后,进行10-1～10-4梯度稀释,取10-2浓度稀释液100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,28℃培养24 h。挑取圆形乳白色单菌落,进一步分离、纯化后,获得纯菌株,编号保存;②PHB颗粒染色初筛产生PHB菌株:用苏丹黑染色法。PHB颗粒呈黑绿色,菌体呈红色。以PHB颗粒大小和生长速率作为标准初步筛选产生PHB菌株;③PHB初步定量测定复筛高产PHB菌株:挑取初筛获得的纯菌株单菌落接种于150 mL锥形瓶(含30 mL种子培养基)中,30℃,180 r/min培养12 h,用作发酵种子。按6%比例转接于250 mL锥形瓶(含50 mL发酵培养基)中,按上述条件培养48 h用于PHB的定量分析。综合比较,筛选高产PHB原始菌株。PHB的初步定量分析按Law和Slepecky法[6]进行。经培养、离心获得的菌体细胞用氯仿60℃抽提1 h后,用浓硫酸100℃处理10 min,冷却至室温并混匀,用紫外分光光度计在235 nm波长下测定吸光值。

1.2.2 鉴定 ①形态特征及生理生化实验:筛选获得高产PHB菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上30℃培养24 h后进行染色观察,48 h后观察菌落形态;生理生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版进行,综合以上各项指标进行初步鉴定;②16S rDNA的PCR扩增、序列测定:用UN IQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌种的基因组DNA,利用16S rDNA通用引物27f和1492r进行PCR扩增。PCR扩增程序:98℃5 min,95℃35 s,55℃35 s,72℃1 min,35个循环;72℃4 min。扩增产物经纯化后连入克隆载体pMD18-T,并由上海生物工程技术有限公司完成测序。将所得基因序列在GenBank进行Blast比对;③gyrB基因的扩增[7]:通过比较蜡样芽胞杆菌和相近种的gyrB(DNA促旋酶B亚单位)基因序列,设计扩增片段大小为365 bp的特异性引物:5′-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3′,5′-TCAT ACGTATGGATGTTATTC-3′。引物由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系:10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP混合液(dATP,dCTP,dGTP,dTTP浓度均为2.5 mmol/L)0.5μL,rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5μL,模板DNA 1μL,引物(20 μmol/L)各0.5μL,ddH2O补足体积至25μL。PCR扩增程序:94℃5 min,94℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,35个循环;72℃5 min。PCR扩增反应产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 PHB产生菌的分离、纯化与筛选

通过分离、纯化和初步鉴定,共获得188株芽胞杆菌菌株。以镜检PHB颗粒的大小和生长速率作为初筛标准,从中选出53株菌株(图1),分别用牛肉膏蛋白胨斜面培养基保藏,待后期进行复筛。

图1 代表性芽胞杆菌菌株菌体苏丹黑染色结果Fig.1 Sudan black dyeing of typicalBacillusstrains

2.2 高产PHB菌株复筛

选出10株积累PHB相对较高的菌株,其中以PX-95菌株(分离自花生地土壤)的积累量最高,PHB产量为135.81 mg/L,结果见图2。故对PX-95菌株进行鉴定。PHB定量标准曲线方程:

其中:X代表PHB的质量浓度;Y代表吸光度,单位为μg/L。根据菌体中提取PHB的吸光度,计算菌体中PHB的含量并转化为mg/L。

2.3 PX-95菌株的鉴定

2.3.1 形态特征 PX-95菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养48 h后,菌落扁平呈白色,无光泽,表面较粗糙。革兰染色呈阳性,菌体杆状,有芽胞,芽胞囊无明显膨胀,菌体大小约为(1.1～1.2)μm×(3.2～5.5)μm;衣鞘薄而无色,有粘性,游离的单菌体常附在外边,侧生鞭毛,单菌能活跃运动;异染颗粒有且较大,占菌体的1/3,菌体内PHB颗粒较多,有的占菌体的3/4。菌落及菌体形态见图3。

图2 10株芽胞杆菌菌株菌体中PHB产量Fig.2 The PHB productions of 10 selectedBacillusin cell

图3 PX-95菌株菌落和菌体形态特征Fig.3 The character ofmorphology and colony of strain PX-95

2.3.2 生理生化特征 PX-95菌株的生理生化特征和生长条件实验结果见表1和表2。

表1 PX-95菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain PX-95

表2 PX-95菌株的生长条件Table 2 culture conditions of strain PX-95

根据PX-95菌株的菌落特征、生理生化特性实验和生长条件实验,参考《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版,初步鉴定PX-95菌株属于芽胞杆菌属蜡样芽胞杆菌群。

2.3.3 16S r DNA基因序列 采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增,获得一长度为1 398 bp的基因,序列测定由上海生物工程技术有限公司完成。将PX-95菌株16S r DNA基因序列通过Blast对比分析,菌株序列与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌同源性都很高,蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌以及产气夹膜梭状芽胞杆菌的16S rDNA基因序列具有高度同源性,它们之间的序列差异一般只有0～9个碱基[8]。根据以上结果,建立芽胞杆菌属系统发育树(图4)。

图4 基于16S rDNA基因序列建立的芽胞杆菌属系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus based on 16S rDNA gene sequence

2.3.4 PCR扩增gyrB基因鉴定 进一步区分蜡样芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌可用PCR扩增gyrB(DNA促旋酶B亚单位)基因。蜡样芽胞杆菌能特异性扩增出365 bpgyrB基因片段,而苏云金芽胞杆菌则无特异性条带。PCR扩增结果表明:该引物对蜡样芽胞杆菌具有特异性,只有蜡样芽胞杆菌能产生特异性条带,其扩增片段为365 bp,而苏云金芽胞杆菌不出现特异性条带,仅见引物二聚体。因此,将PX-95菌株确定为苏云金芽胞杆菌(图5)。

图5 gyrB基因的PCR扩增结果Fig.5 PCR analysis of gyrB gene

3 讨 论

PHB具有多种优良特性,作为目前最具代表性的一类生物材料,PHB的开发及应用逐步加大。随着人们环保意识的增强,其发展远景也得到了国际上的广泛认可,吸引了众多科研工作者的关注,成为国际研究开发热点[8]。目前国际上主要采用的方法是筛选获得产PHB的菌株,并通过各种方法提高其产量。如寻找微生物能够利用的廉价碳源和培养材料,应用遗传操作构建基因工程菌,此外还有一些研究尝试在植物体中合成PHB[9]。

目前国内外芽胞杆菌属合成PHB的相关研究相对较少:周琴等[10]筛选得到了1株产量0.763 g/L的巨大芽胞杆菌;吕早生等[11]提取、鉴定了蜡样芽胞杆菌产的聚羟基烷酸;郭秀君等[12]研究了蜡样芽胞杆菌芽胞形成与PHB的关系。邵志会等[13]建立了苏云金芽胞杆菌的代谢动力学模型,成功地模拟了该菌株的生长、葡萄糖、聚-β-羟基丁酸(PHB)、吡啶二羧酸(DPA)和毒蛋白(ICPs)的变化过程,严瑾等[14]构建了苏云金芽胞杆菌工程菌株,考察了胞内聚-β-羟基丁酸对菌体生理的影响,结果表明PHB能增强菌体对逆境的耐受能力。Pinar Kaynar[15]从鱼内脏中筛选获得了30株芽胞杆菌,其中巴氏芽胞杆菌P2中PHB占菌体干重20.58%,而缓慢芽胞杆菌P18菌体中PHB达到了菌体干重的23.38%。Valappil[16]报道了1株以葡萄糖为碳源,PHB含量占菌体干重38%的蜡样芽胞杆菌SPV。

本文筛选获得1株产聚-β-羟基丁酸较高的芽胞杆菌菌株,通过PCR扩增(DNA促旋酶B亚单位)gyrB基因的方法将其鉴定为苏云金芽胞杆菌,此PCR检测方法能特异性扩增出蜡样芽胞杆菌,其扩增片段大小为365 bp,而苏云金芽胞杆菌则无特异性条带,且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应,因此,可以应用于苏云金芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌的区别鉴定。

该菌的16S rDNA基因序列已在GenBank上登录,登录号为JN182235,其积累PHB的能力较强,可达菌体干重的40.2%。该菌的培养条件还需进一步进行各种因子的交互实验,尤其是培养基的碳氮比,对菌株产PHB的能力有重大的影响,有望通过培养条件优化,产量可以大幅度提高,是1株具有较好应用前景的菌株。

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