18β－甘草次酸对豚鼠微动脉平滑肌细胞BKCa通道的增强作用

李新芝，司军强，李丽，朱贺，赵磊，马克涛

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

微动脉是小动脉的末梢分支，和小动脉共同决定了血管的外周阻力。血管微动脉通过细胞间缝隙连接通道直接进行电和化学信号交流，使血管壁能够在纵向和横向上保持电活动、机械活动的同步性，整个血管成为统一的功能单位，维持了血管正常生理功能的稳定和一致［1］。病理情况下，细胞间缝隙连接的结构和功能受到损伤，使血管细胞间的同步收缩发生障碍［2］。18β－甘草次酸（18β－Glycyrrhetinic acid，18βGA）是从中草药甘草中提取的有效成分。在血管微动脉，18βGA能够非选择性的抑制平滑肌细胞间、内皮细胞间以及肌内皮缝隙连接［2－3］。除抑制细胞间缝隙连接外，18βGA还可以抑制肿瘤细胞增殖［4］、抗炎抗菌［5］、抗病毒［6］、抗氧化［7］和抗心律失常等作用。本实验应用全细胞膜片钳技术观察了18βGA对小脑前下动脉（anterior inferior cerebellar artery，AICA）和肠系膜动脉（mesenteric artery，MA）平滑肌细胞膜电流影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物及标本制备

实验所用豚鼠（新疆自治区疾病控制中心动物饲养科提供，动物质量符合一级标准）雌雄不拘，重约250～500g，在麻醉状况下放血处死，迅速取出肠系膜和脑，并置于含有95%O2和5%CO2的37℃饱和生理盐溶液（Krebs）中。Krebs液成分是：NaCl 125mmol／L，KCl 5mmol／L，CaCl21．6 mmol／L，MgCl21．2mmol／L，NaH2PO41．2mmol／L，NaHCO320mmol／L，葡萄糖 8．3mmol／L，将pH调至7．4。在Krebs液中，迅速取出AICA和MA。

单个平滑肌细胞制备：将微动脉放于细胞分离液中20min，细胞分离液成分为：NaCl 142mmol／L，KCl 5mmol／L，CaCl20．05mmol／L，MgCl21 mmol／L，Na－HEPES 4mmol／L，HEPES 5mmol／L，葡萄糖7．5mmol／L。将微动脉剪成几段放入消化液后，在37℃温箱中消化20～25min，消化液成分包括：木瓜蛋白酶0．75g／L，胶原酶IA 1g／L，牛血清白蛋白3．75g／L，二硫苏糖醇0．3g／L。1000 r／min离心（r＝10cm）6min后弃上清液，加入细胞分离液制成细胞悬浮液，如此反复替换三次后，将液体移至用多聚赖氨酸处理过的培养皿内，静置30 min使细胞贴壁。灌流液冲洗20min后进行全细胞膜片钳实验。灌流液成分如下：NaCl 138mmol／L，KCl 5mmol／L，CaCl21．6mmol／L，MgCl21．2 mmol／L Na－HEPES 5mmol／L，HEPES 6mmol／L，葡萄糖7．5mmol／L。

1．2 全细胞膜片钳记录

在室温条件下（22℃～25℃）标本持续灌注HEPES液（0．2mL／min）进行全细胞膜片钳实验。记录电极尖端直径约为1μm，电极阻抗约为5MΩ，由P－97拉制仪拉制。电极内液成分是：K－gluconate 130mmol／L，NaCl 10mmol／L，CaCl22．0 mmol／L，MgCl21．2mmol／L，HEPES 10mmol／L，EGTA 5mmol／L，葡萄糖7．5mmol／L，调节pH 值到7．2，渗透压290mOsm／L。通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳。膜电流用5或10kHz（－3dB）低频滤过。生物电信号通过PC计算机记录。采样间隔为10、20或100μs［8］。

1．3 实验所用药物

所用药物用HEPES液配制，通过开关控制药物灌流标本，保持灌流速度、温度和其它成分不变。所用药物有：18β－glycyrrhetinic acid（18βGA），4－aminopyridine（4AP），tetraethylammonium（TEA），Charybdotoxin（ChTX）由Sigma Research Biochemicals Inc．提供。

1．4 统计方法

实验结果以mean±SE表示，组间比较采用t检验，以P＜0．05为有统计学差异。

2 结果

2．1 300μmol／L 18βGA增强微动脉平滑肌细胞外向电流

图1a为在gap－free模式下记录到的18βGA对MA微动脉平滑肌细胞膜电流的影响，18βGA显著增强微动脉平滑肌细胞外向电流，图1b显示300 μmol／L 18βGA使AICA和MA平滑肌细胞外向电流（＋40mV）分别从234±36pA和154±25pA增强到376±41pA（n＝8，P＜0．05）和348±45pA（n＝11，P＜0．01）。18βGA激活的外向电流具有电压依赖性，18βGA对微动脉平滑肌细胞I／V曲线中－60～0电压区间膜电流的影响很小，主要增强0～＋40mV电压区间的电流，其中对＋40mV阶跃电压激活电流的增强最大（图1c和图1d）。

图1 18βGA对微动脉平滑肌细胞外向电流的增强作用Fig．1Enhanced effect of 18βGA on whole－cell current of VSMCs

2．2 18βGA对微动脉平滑肌细胞全细胞膜电流的影响由BKCa通道介导

实验中将300μmol／L 18βGA净电流（图2a）与大电导钙激活钾通道（big conductance calcium－activated K＋channel，BKCa）阻断剂10mmol／L TEA、50nmol／L ChTX以及电压依赖钾通道（voltage－de－pendent K＋channels，Kv）阻断剂1mmol／L 4AP的净电流（图2b、c、d）进行比较，结果发现18βGA净电流与TEA和ChTX相似，与4AP不同。此外，实验中背景灌流10mmol／L TEA阻断BKCa通道后，300μmol／L 18βGA对微动脉平滑肌细胞外向电流的增强作用消失（图3）。

图2 18βGA、TEA、4－AP和ChTX净电流的比较Fig．2Comparison of the net current induced by 18βGA，TEA，4－AP and ChTX respectively

图3 300μmol／L 18βGA激活的微动脉平滑肌细胞外向电流由BKCa通道介导Fig．3 300μmol／L 18βGA activated the outward currents of VSMCs mediated by the BKCachannel

3 讨论

18βGA作为中草药甘草的有效成分，也是目前常用的非选择性强效缝隙连接阻断剂。前期实验发现在豚鼠不同部位的微动脉上18βGA可以浓度依赖和可逆的抑制细胞间缝隙连接，EC50为2～4μmol／L，当18βGA浓度≧30μmol／L时可以完全阻断微动脉细胞间缝隙连接［2］，18βGA对不同部位微动脉细胞间缝隙连接的抑制效力相似提示微动脉细胞间缝隙连接的构成可能是相同的。除抑制微动脉细胞间缝隙连接外，本实验首次发现300μmol／L18βGA能够电压依赖的激活平滑肌细胞膜上的BKCa通道，进一步拓展了18βGA在血管微动脉上的药理作用。本实验中也尝试应用更高浓度的18βGA（1～3mmol／L）观察其对微动脉平滑肌细胞膜电流的影响，结果造成细胞Ca2＋振荡，细胞膜电流很不稳定，未能收集到有效数据，但趋势与300 μmol／L 18βGA相一致。前期实验我们在消化的单个MA和AICA平滑肌细胞上发现应用较低浓度的18βGA（10～100μmol／L）可以浓度和电压依赖的抑制平滑肌细胞膜上BKCa通道，与本实验结果相反，其中的机制尚需进一步研究。此外，有报道称在大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上18βGA能够抑制电压依赖性 Ca2＋通道［3，9］。

血管微动脉主要由内皮细胞和平滑肌细胞组成，其中平滑肌细胞上表达多种离子通道，其中K＋通道分布最丰富。血管微动脉平滑肌细胞上主要表达内向整流K＋通道（inward rectifier K＋channel，Kir）、ATP敏感 K＋通道（ATP－sensitive K＋channel，KATP）、Kv 和 BKCa［10］。Ca2＋激 活 K＋通 道（Ca2＋－activated K＋channel，KCa）是一个大家族。根据其电导值及药理特性之差异，世界药理学联合会将KCa又分成3个亚类，即大电导的BKCa、中电导的IKCa和小电导的SKCa。在血管平滑肌细胞上主要表达大电导Ca2＋激活的K＋通道，即BKCa通道。细胞内游离Ca2＋浓度升高和细胞膜去极化激活BKCa通道，BKCa通道生理功能主要是维持小的肌原性血管细胞的静息膜电位［11］，BKCa通道激活引起K＋外流以对抗压力和化学物质引起的去极化和血管收缩［12］。

总的来说，本实验发现在微动脉上≥300μmol／L的18βGA可以通过激活BKCa通道引起K＋外流，舒张血管。

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