小拟南芥Na＋／H＋逆向转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

院海英，顾超，徐芳，崔百明，黄先忠

（石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，石河子832003）

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度的Na＋对许多高等植物都造成很大的伤害，严重影响着植物的生长和发育。据联合国科教文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地面积约有9．5438亿hm2，占所有陆地面积的7%。在15亿hm2可耕地中800万hm2受到盐的危害，约占所有可耕地面积的6%。其中，我国的盐碱土地面积有9913万hm2，占世界盐碱土壤的1／9［1］。更关键的是，由于化肥的大量使用和不合理的灌溉，盐渍化程度正在加剧，严重威胁着人类耐以生存的非常有限的土地资源。土壤中高浓度盐是造成全世界许多农作物大幅度减产的重要原因之一。

高盐环境是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。为了能够适应高盐环境，植物在进化过程中，演化出3种机制来阻止过多的Na＋在胞液中的积累，包括：降低Na＋的吸收、Na＋的外排和Na＋的区隔化，并控制其长距离运输至地上部分［2－3］。目前Na＋吸收过程还不十分清楚，但Na＋的外排和区隔化是间接的主动运输过程，主要由Na＋／H＋逆向转运蛋白来完成。Na＋／H＋逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关，近年来受到广泛关注，成为国际研究的热点之一，其利用质膜 H＋－ATPase或液泡膜 H＋－ATPase及H＋－PPase泵H＋产生的驱动力把Na＋排出细胞或将其区隔化入液泡中以消除Na＋的毒害［4－6］。近年来，人们对植物耐盐的分子机制的研究已经取得了较大的进展。但是，植物的耐盐性是一个复杂的问题，也存在很多的问题需要进一步阐明。所以，对植物耐盐性的进一步探索，还需从更多的盐生植物着手，挖掘更多的耐盐相关基因，才能真正从细胞、组织和整体水平上阐明植物盐胁迫的信号转导机制，从而为植物的遗传改良奠定基础。

新疆小拟南芥（Arabidopsis thaliana）是新疆特殊生境下广泛分布的植物之一。虽然和拟南芥（Arabidopsis thaliana）有很多相似之处，但二者生长的环境有很大差异［7］。近年来对小拟南芥耐盐生物学特性进行初步的研究，发现小拟南芥适应于新疆特殊环境，具有耐受高浓度NaCl胁迫的特性［8－9］，通过同源克隆法先后从小拟南芥中克隆了一些耐逆基因［10－12］。本研究通过同源克隆的方法从小拟南芥克隆了1个液泡膜Na＋／H＋逆向转运蛋白基因完整开放阅读框cDNA，并利用一系列生物信息学软件分析该蛋白的理化性质、结构域、跨膜特性、系统进化等，构建植物过量表达载体，以期为进一步研究该基因的功能打下基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料

小拟南芥（Arabidopsis pumila）和拟南芥Col－0（Arabidopsis thaliana）种子为本实验室保存。种子发芽培养基为1／2MS固体培养基。其成分：1%葡萄糖（Glucose），2．2g／L MS盐（Murashige ＆SkooG MEDIUM）（Duchefa Biochemie，Netherland），0．05%2－吗啉乙磺酸（MES）（Amresco，A－merica），0．8%琼脂粉（Agar），pH 5．8。

1．1．2 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101、植物过量表达载体pCAMBIA2300－35S为本实验室保存。

1．2 方法

1．2．1 小拟南芥的培养

在超净台上先用70%的酒精洗涤种子1min，然后用20%Bleach灭菌处理10min。用无菌水洗4～5次，每次充分振荡混匀。将小拟南芥种子在4°C下处理3－4d。均匀地将种子播撒在1／2MS平板上，放置于16h光照和8h黑暗的光照培养箱中，培养1周后，于2～3片真叶期，移栽到含有蛭石和营养土（1∶1）的盆钵中，之后放置到同样16h光照和8h黑暗的光照培养间里培养。将幼苗移栽至土里生长1周后，以200mmol／L的NaCl于早晨10：00从根部浇灌进行胁迫处理12h，每4h浇灌1次，晚上22：00收集材料，将收获的叶片迅速置于液氮中冷冻，－80℃冰箱保存以备用。

1．2．2 RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取采用TIANGEN公司的RNA prep pure Plant Kit试剂盒（离心柱型），参照说明书提取。cDNA模板第一链的制备，根据Promega公司M－MLV Reverse Transcriptase合成。

1．2．3 引物的设计及合成

为了扩增小拟南芥液泡膜Na＋／H＋逆向转运蛋白基因NHX1，根据植物中已经发表的基因序列，设计 引 物 ApNHX1F4：5′－ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC－3′和 引 物 ApNHX1R4：5′－ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC－3′用作PCR扩增。

1．2．4 基因的克隆和序列分析

RT－PCR扩增时，以叶片的cDNA为模板，在50μL的反应体系中加入上述cDNA模板2μL，5 μL 10×Ex Taq Buffer，dNTP 各0．2mmol／L，正反向引物各5nmol，1UEx Taq DNA聚合酶（TaKaRa），ddH2O补齐。PCR反应程序为：94℃，2min，后94℃45s，56℃45s，72℃2min，35个循环后72℃延伸10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测，割下目的条带，利用凝胶回收试剂盒（promega）纯化后，将回收产物连接到载体pMD18－T上（TaKaRa）。将连接产物转化DH5α感受态细胞，在涂有IPTG／X－gal及氨苄抗生素的LB平板上通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆于LB培养基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定，将鉴定正确的质粒交由北京华大基因公司测序，构建成pMD18－T：：ApNHX1。

1．2．5 序列分析和进化树构建

测序结果利用DNAstar软件分析载体及引物序列，在 NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）中下载相关的NHX1蛋白序列，利用 MEGA 4．1（molecular evolutionary genetics analysis，version 4．1）软件进行所有已知NHX1蛋白的系统进化分析，蛋白序列比对利用Clustal W程序进行，进化树利用Neighbor－Joining方法构建，其中进行1000次Bootstrap分析，以使得分枝的结果更可靠［13］。

蛋白的结构域预测利用GenBank上的blastp软件 （http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blasp）；蛋白理化性质预测用 ProtParam （http：／／www．expasy．ch／tools／protparam．html）分析；蛋白的二级结构 预 测 用 SOPMA （http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿automat．pl？page＝／NPSA／npsa＿sopma．html）软件；蛋白氨基酸序列的疏水性／亲水性 分 析 用 ProtScale（http：／／expasy．org／tools／protscale．html）分析。

1．2．6 过量表达载体的构建

测序正确的质粒pMD18－T：：ApNHX1，用BamHⅠ和XbaⅠ酶切回收目的片段，同时用同样的双酶切pCAMBIA2300－CaMV35S－OCS载体回收质粒大片段，经T4连接酶（TaKaRa）连接后，将连接产物p35S：：ApNHX1经热激法转化DH 5α感受态细胞，挑取克隆进行菌落PCR鉴定，提取质粒，进行酶切鉴定。

鉴定正确的质粒，用热激转化法转化农杆菌GV3101菌株，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定正确的单克隆保存菌液。

2 结果与分析

2．1 ApNHX1基因的克隆与测序

新疆小拟南芥的种子采自于石河子周边，发现其生活的环境与拟南芥不尽相同。

在实验室中进行了萌发实验，首先将拟南芥和小拟南芥的种子播种在1／2MS培养基上分别萌发，生长1周后将幼苗转入含200mmol／L NaCl的1／2MS培养基上中培养3d后，发现拟南芥已经全部白化死亡，而小拟南芥依然正常生长（图1），这说明小拟南芥具有一定的耐盐能力，将此时的小拟南芥的幼苗收集起来，经液氮研磨，提取总RNA，反转录成cDNA，作为RT－PCR反应的模板。

图1 200mmol／L NaCl对拟南芥和小拟南芥幼苗生长的影响Fig．1Comparison of shoot growth of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis pumila on 200mmol／L NaCl

利用引物组合ApNHX1F4和ApNHX1R4，扩增出了约1．6kb的产物（图2A），将此PCR产物回收纯化后连接到pMD18－T载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆提取质粒经双酶切鉴定（图2B），获得阳性克隆pMD18－T：：ApNHX1。

挑选其中3号克隆测序，测序结果经DNAstar软件分析，发现该序列包含全部的编码区序列，全长1617bp，推测编码538个氨基酸的多肽，将该基因命名为ApNHX1（GenBanK 登录号：JF357965）。同拟南芥的AtNHX1蛋白氨基酸比对分析表明相似性可达99%，二者只有2个氨基酸的不同（图3）。

在ApNHX1中105位是半胱氨酸C（Cysterine），而 AtNHX1是精氨酸 R （Arginine），ApNHX1的130位的甘氨酸A（Alanine），而AtNHX1为苏氨酸T（Threonine）。这2个氨基酸主要在第4的跨膜区 TM4。与 AtNHX1、AtNHX2、AlNHX1、ThNHX1、BnNHX1、LeNHX1、GhNHX1、HvNHX2、OsNHX1、TaNHX1蛋白相同位置氨基酸的比较结果（图3），表明105位的C是小拟南芥特有的，130的A在11个蛋白中也不尽相同，暗示着这2个氨基酸可能起着重要的作用。由比对结果来看，在该跨膜区段11个NHX1蛋白的氨基酸具有很高的相似性。并且LFFIYLLPPI序列是高度保守的，这一区段被认为是Na＋／H＋逆向转运蛋白活性阻遏物氨氯吡嗪脒（amiloride）的结合位点［2，6］。

图2 新疆小拟南芥ApNHX1基因的扩增与酶切鉴定Fig．2PCR amplification of ApNHX1 （A）and identification of pMD18－T：：ApNHX1by restriction enzyme cut（B）

图3 11个ApNHX1基因蛋白序列的保守区比对分析Fig．3Alignment of conserved domain of ApNHX1 proteins from 11different plant species

2．2 ApNHX1的序列特征分析

在NCBI上对ApNHX1蛋白保守域分析结果发现和拟南芥的有明显不同（图4），缺少了拟南芥的kefB保守域［14］，该结构域是K＋转运系统。b＿cpa1、NhaP和a＿cap1结构域是无机离子逆向转运蛋白的保守结构域；Na＿H＿Exchanger是Na＋／H＋交换体家族；COG3263是NhaP的一种类型；PRK05326是K＋／H＋逆向转运蛋白。

图4 新疆小拟南芥ApNHX1蛋白的结构域Fig．4Conserved domain of ApNHX1protein

用ProtParam分析软件对ApNHX1编码蛋白的理化性质进行预测。推测该蛋白的分子式为C2734H4243N677O752S25，分子量是59430．3Da，等电点PI 6．56。理论推导其半衰期分别为：30h（体外，哺乳动物的网织红细胞内）；大于20h（体内，酵母细胞内）；大于10h（体内，大肠杆菌）。不稳定参数是32．7，属于稳定蛋白。

通过SOPMA预测ApNHX1蛋白的二级结构（图未列出），表明该蛋白的氨基酸序列中，共有α－螺旋（Alpha helix）259处，占二级结构的48．14%，延伸链（Extended strand）866处，占总二级结构的15．99%，β－转角（Beta turn）22 处，占二级结构的4．09%；无规卷曲（Random coil）81处，占二级结构的31．78%。

用ProtScale预测ApNHX1蛋白氨基酸序列的疏水性／亲水性的结果表明，多肽链第372位的丝氨酸S（Serine）具有最低的分值－2．444，第31位的半胱氨酸C（Cysteine）具有最高的分值3．233（图5）。依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可以看出，在第372位的Ser亲水性最强，第31位的Cys疏水性最强，而就整体来看，疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且多于亲水性氨基酸。因此，整个多肽链表现为疏水性，没有明显的亲水区域，可认为小拟南芥Na＋／H＋逆向转运蛋白是疏水性蛋白，这说明该逆向转运蛋白符合跨膜蛋白的特征。

图5 小拟南芥Na＋／H＋逆向转运蛋白ApNHX1的疏水性／亲水性预测Fig．5Predicted hydrophobicity／hydrophilic for Na＋／H＋antiporter from Arabidopsis pumila

2．3 NHX1蛋白系统进化树分析

高等植物的Na＋／H＋逆向转运蛋白基因最早是从拟南芥中克隆的［15］，后来陆续在至少在50种以上的植物中分离到了该同源基因。比较这些基因编码的氨基酸序列，相似性很高，最高可达90%以上。利用Mega4．1构建系统进化树（图6），系统进化分析表明植物的NHX1同源基因遗传分化较为紧密，按照单子叶和双子叶分别进化。并且盐生植物的NHX1基因聚在一个分支，禾本科的NHX1基因亲缘关系较近。小拟南芥和拟南芥、琴叶鼠尔芥、盐芥、油菜等植物的NHX1遗传距离最近，属于一类（classⅠ）液泡膜Na＋／H＋逆向转运蛋白基因。

图6 植物Na＋／H＋逆向转运蛋白NHX1系统进化树分析Fig．6Phylogenetic tree of Na＋／H＋antiporter protein from different plants

2．4 p35S：：ApNHX1植物过量表达载体的构建

为了构建过量表达载体，又设计了两端分别带有BamHⅠ和XbaⅠ双酶切位点的引物ApNHX1F5：5′－CGGGATCCATGTTGGATTCTCTA GTGTCGAAAC－3′和 ApNHX1R5：5′－GCTCTAG ATCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGGG－3′。以测序正确的pMD18－T：：ApNHX1质粒为模板，再次扩增ApNHX1基因，克隆鉴定的方法同上。测序验证正确后，将该质粒经BamHⅠ和XbaⅠ酶切回收1613bp目的片段。同时将质粒pCAMBIA2300－CaMV35S－OCS用BamHⅠ和XbaⅠ酶切，回收质粒大片段。将1613bp的基因片段和质粒大片段经T4连接酶连接。连接产物的转化方法同上。转化后的质粒用BamHⅠ和XbaⅠ进行酶切鉴定，酶切产物和pMD18－T：：ApNHX1质粒酶切大小一致，均在接近2Kb处有一目的条带，表明插入片段连接到目的载体上了（图7A），这样构建了植物过量表达载体：p35S：：ApNHX1。最终载体p35S：：ApNHX1含有烟草花叶病毒CaMV35S启动子，章鱼碱合成酶基因OCS作为终止子，及植物筛选标记新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ（图7B）。

2．5 p35S：：ApNHX1转化农杆菌及验证

将质粒p35S：：ApNHX1经热激转化法转化农杆菌感受态细胞GV3101，转化产物均匀的涂布在含有卡那（50mg／L）／利福平（25mg／L）抗性的 LB固体平板上涂匀，经28℃温育48h，挑取单克隆，利用引物ApNHX1F4和ApNHX1R4进行PCR检测，扩增产物与ApNHX1基因产物大小一致（图7B）。结果表明植物过量表达载体p35S：：ApNHX1已经转入农杆菌GV3101中了。

图7 植物过量表达载体p35S：：ApNHX1的构建Fig．7Construction of over－expression vector of p35S：：ApNHX1

3 结论与讨论

在盐胁迫下，植物细胞的离子均衡受到破坏，植物细胞为避免离子毒害，通过限制Na＋吸收、将Na＋外排或区隔化Na＋进入液泡来维持离子均衡。目前，学者们一致认为植物液泡Na＋区隔化主要依赖于植物液泡膜上Na＋／H＋逆向转运蛋白的活性，该蛋白的活性在维持细胞内的离子均衡方面起到关键作 用［2－3，15］。 拟 南 芥 的 AtNHX1 蛋 白 是 跨 膜 蛋白，具有12个推测的跨膜区域，AtNHX1的N末端朝向细胞质，但几乎整个C端都位于液泡腔中。N端很保守，对于转运蛋白的转运活性非常重要，而C端变化很大，可能起调节作用［14－15］。

通过同源克隆的方法，从新疆小拟南芥中克隆得到了1个Na＋／H＋逆向转运蛋白基因ApNHX1，比对分析和进化树构建表明与拟南芥液泡膜上的AtNHX1相似性最高、亲缘关系最近，同属classⅠ类的液泡型的Na＋／H＋逆向转运蛋白。而生物信息学分析的结果表明在氨基酸的理化性质、蛋白质的保守结构域、跨膜结构等很多方面与At－NHX1还是有着明显的不同。在ApNHX1蛋白的TM4跨膜区有2个关键的氨基酸，105位的半胱氨酸C和130位的甘氨酸A，在AtNHX1分别是精氨酸R和苏氨酸T。本研究结果也表明小拟南芥和拟南芥的基因组有很高的相似性，但比拟南芥具有更高的耐盐性，是不是2个氨基酸的突变影响蛋白的功能，还需进一步研究。

为了进一步研究该基因的功能，构建了植物过量表达载体p35S：：ApNHX1，并且通过PCR检测已将该载体转化农杆菌GV3101中，目前正在进行拟南芥和小拟南芥的遗传转化研究。下一步研究将分析不同组织及不同胁迫情况的基因表达情况，以及研究亚细胞定位。我们的研究将进一步解析植物NHX1基因家族如何行使功能的，丰富植物耐盐信号传导的分子机制。

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