绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养

罗燕，赵宗胜，谷新利，邵永斌，时敏

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

肌内脂肪（Intramuscular fat，IMF）是存在于肌外膜、肌束膜或肌内膜上的脂肪，营养状况好的家畜，其肌纤维膜的毛细血管上也有脂肪沉积。研究发现，畜禽IMF含量、比例和分布状况，与肌肉的多汁性、嫩度、肉色、大理石纹以及肌肉pH值等肉品评价指标都有很强的相关性［1］，是影响动物肉品质和风味的决定因素之一。近年来，如何在不影响动物生长、并保持整体脂肪率较低的情况下，适当提高肌内脂肪含量以提高肉品质，已经成为当前相关畜牧生产面临的一个重要课题，而对于作为肌内脂肪组织的基本单元——前体脂肪细胞的增值分化能力及其影响因素的研究，具有非常重要的意义。

前体脂肪细胞的体外培养不仅能完整地认识脂肪组织发生和增生的全过程，并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控。目前，国内已经建立了猪［2－3］、牛［4－5］前体脂肪细胞原代和传代培养模型，取材部位有皮下、肌内和网膜脂肪组织等，但目前有关绵羊肌内前体脂肪细胞培养体系的建立还未见报道。

“君子文化不仅是传统文化的一个重要制高点，还是一个关键融汇点。”[1]118-124 君子文化丰富博大，其内蕴前人学者多有阐发，诸如仁义礼智信、忠孝节义等特质早已纳入并根植中华民族的文化心理与民族精神之中。 注杜是一种民族心理的体现，这种民族心理外化表现出诸多形式，其核心正是儒家君子文化。 子曰：“质胜文则野，文胜质则史。 文质彬彬，然后君子。”(《论语·雍也》)杜诗文质兼备，不仅蕴含着高超的文学艺术价值，也融汇了儒家传统文化精髓。 君子文化在这一时期文人注杜中的表现方式大致可以梳理出以下几个方面。

本实验旨在摸索建立绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养模式，为后续通过反刍动物营养调控（如营养素等）手段调控肌内脂肪的发育、肌内脂肪沉积机制的研究提供一种简便有效的细胞模型，旨在为今后改善本地绵羊肌内脂肪含量、改善羊肉品质奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 组织来源

将密度为1×105个／mL的细胞悬液等量接种至24孔培养板中，随机分为10组，每组3孔。完全培养液培养至细胞接触抑制，换用分化培养液（记作第0天），之后每天取出3孔细胞测定脂肪含量，直至第10天结束。测定时弃去培养液，PBS涮洗2次，10%中性甲醛溶液固定30min，蒸馏水漂洗2次，油红O工作液浸染2h，蒸馏水漂洗数次，烘干水分后加入1mL异丙醇进行萃取，吸出萃取液，于722型分光光度计510nm处测定吸光度。

1．1．2 主要试剂配置和仪器

1．2．4．2 前体脂肪细胞的油红O染色法鉴定

1．2 方法

1．2．1 绵羊肌内前体脂肪细胞的原代培养［4］

例2：...there was laughter fromunheard jokes,and lighted cig-arettesmade unintelligible circles inside.

1．2．1．1 组织块培养法

1．2．4．3 前体脂肪细胞内脂肪含量测定

1．2．1．2 单层细胞培养法

4K指分辨率达到3840×2160，8K指分辨率达到7680×4320。以往旧型号电视机多以720P高清（1280×720）分辨率为标准，其后1080P全高清（1920×1080）盛行。

取材及洗涤同组织块培养法；将0．5～1．0mm3的组织小块移入离心管中，含双抗的PBS漂洗数次，加入5倍体积的1mg／mLⅠ型胶原酶消化液，密封管口，置于37℃恒温水浴箱中消化1h（每隔3 min摇动1次）；加入完全培养基终止消化，不锈钢细胞筛过滤，收集滤液于另一离心管中，1000r／min，8min；细胞沉淀经基础培养液漂洗2次，完全培养液吹打制成细胞悬液；计数，调整细胞密度至1．0×105个／mL，接种于25cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中静置培养，24h后换液以除去血细胞和未贴壁细胞，之后每隔2～3d换液1次。

1．2．2 绵羊肌内前体脂肪细胞的传代培养［5］

目前包括3G/4G/5G在内的陆上移动通信技术应用广泛。3G的通信速率一般约为2 Mbit/s，而4G/5G的传输速率更优于3G技术。如果3G/4G/5G移动通信技术能够在近岸条件下的船岸通信中得以应用，将极大地提高数据传输速率，使近岸船舶获得实时航行安全信息成为可能。

原代细胞培养至80%～90%汇合时，弃去培养液，PBS涮洗2遍，0．25%胰蛋白酶消化液在37℃下消化2～3min，显微镜下观察细胞形态回缩并有个别细胞飘起时，弃去消化液，加入完全培养液终止消化，吹打成细胞悬液，按1∶3或1∶4的比例进行传代接种培养，标记为P1（第1代）。传代培养过程中，每2～3d换1次完全培养液，直至细胞汇合并铺满整个培养皿后，再重复上述操作继续传代。

四个人面面相觑。上官星雨捏着玉玦，将头伸进缺口。缺口之下，三五尺之深，水面如镜，映照出花容月貌的女孩儿自己。对，那就是她，跟之前在黄河岸边看到的一脸泥炭的乞丐不同，她的剪剪秋水，漆黑头发，海棠般的脸，明亮俏丽，这花瓣雨的洗濯，又让她回到上官家小姐的样子。

原代细胞培养至80%～90%汇合时，经胰蛋白酶消化、洗涤后收集细胞，按每孔5．0×104个细胞等量接种至2个24孔培养板内，随机分为10组，每组3孔。于37℃5%CO2培养箱中继续培养，记作第0天，以后每天取3孔细胞消化，每孔计数3次，结果以3孔的细胞均数表示，如此至第10组结束。

1．2．4 绵羊肌内前体脂肪细胞的诱导分化与初步鉴定［7］

将密度为1×105个／mL的细胞悬液等量接种至事先铺有无菌盖玻片的培养皿中，完全培养液培养至细胞接触抑制，换用分化培养液进行诱导分化（记作第0天），之后每2d换液1次，直至第10天。

1．2．4．1 前体脂肪细胞的诱导分化

由表4可以看出，施用腐殖酸螯合肥后单果重、果实横径、果实纵径及可溶性固形物都有明显增加，处理1较处理2单果重增加了5 g、果实横径增加了0.7 cm、果实纵径增加0.9 cm、可溶性固形物增加2.1%；处理1较处理3单果重增加了12 g、果实横径增加了0.6 cm、果实纵径增加1.3 cm、可溶性固形物增加1.4%。

基础培养基：DMEM／F12培养粉1袋（GIBCO，12500－062），2．438g NaHCO3，灭菌超纯水定容至1000mL。完全培养基：90mL基础培养基，10 mL胎牛血清（GIBCO，743794），青、链霉素终浓度均为100U／mL。分化培养基：完全培养基内加入终浓度为10μg／mL 胰岛素（INS，Sigma，I5500），1．0μmol／L 地塞米松（DEX，Sigma，D1756），0．5 mmol／L 3－异 丁 基－1－甲 基 黄 嘌 呤 （IBMX，Sigma，17018）。1mg／mLⅠ型胶原酶消化液：25mgⅠ型胶原酶（Sigma，C0130），0．25g牛血清白蛋白，25 mL PBS溶解。0．25%胰蛋白酶消化液：0．25g胰蛋白酶（Sigma，1∶250）溶于100mL PBS中。上述溶液均需调整pH值至7．2～7．4，0．22μm微孔滤膜正压过滤除菌，分装后置于－20℃保存。油红O工作液：0．7g油红O，溶于200mL异丙醇中，室温静置过夜，分析滤纸过滤，滤液加入150mL灭菌蒸馏水，4℃静置过夜，过滤2次后室温储存。DKZ－2型恒温水浴箱（上海精安实验仪器厂）；FORMA3111型CO2恒温培养箱（Thermo公司）；LeicaDMI3000M型倒置显微镜（浙江省科学器材进出口有限责任公司）；722型分光光度计（上海市光棱技术有限公司）。

红军在进入川西北地区之初，就这样争取少数民族的支持并使之投身革命斗争，从封建压迫下解放出来的问题，进行了仔细的研究，显示出中央对这一问题的极大关注，意识到了群众工作的重要性。

取出上述爬满细胞的盖玻片，PBS漂洗2次，10%中性甲醛固定30min，蒸馏水漂洗2次，油红O浸染2h，蒸馏水漂洗数次，苏木精复染5min，自来水冲洗，干燥，中性树胶封片，显微镜下观察脂滴着色情况。

1．2．3 细胞生长曲线的测定［6］

脂肪组织用PBS（含青霉素、链霉素各400U／mL）漂洗5次，仔细剔除血管和结缔组织，剪成0．5～1．0mm3的小块，置于无菌培养皿中，加入少量完全培养液悬浮组织小块；用吸管分次吸取组织块，将其均匀贴附于培养皿底壁上，置37℃、5%CO2培养箱中约4h，待组织块牢固粘附于培养皿底壁后，加适量完全培养液浸泡组织块，静置培养3d；3 d后补加或更换培养液，并吸出漂浮的组织块；之后每隔2d换液1次。

于石河子市活畜屠宰场选取健康绵羊1只，快速无菌分离肌内脂肪组织，放入预先备好的含双抗（青、链霉素各400U／mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，带回实验室。

2 结果

2．1 形态学观察

2．1．1 组织块培养法

组织块经贴壁培养4～5d后，其边缘可见游离出少量梭形或不规则形的成纤维样细胞（图1a）。8～9d后有多量细胞开始贴壁生长（图1b）。14～15d可形成单层汇合，细胞以组织块为中心呈放射状或漩涡状生长；随着细胞密度增加，有少数细胞内出现数量不等的微小脂滴（图1c中箭头所指）。当细胞密度进一步增大时，甚至出现重叠生长，细胞因营养和代谢物等因素，出现生长抑制，少量细胞开始脱落。

《支持计划》围绕乡村教师“下不去、留不住、教不好”三个核心问题，从乡村教师师德水平、补充渠道、生活待遇、编制标准、职称评聘、交流制度、能力素质和荣誉制度等八个方面开始全方位、立体化地解决乡村教师队伍建设中面临的突出问题。基于此，通过对2 888名乡村教师开展研究分析，以期从《支持计划》的八大方面进行深入探析乡村教师生存状态。

图1 组织块法培养绵羊肌内前体脂肪细胞（200×）Fig．1Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of explant techniques（200×）

2．1．2 单层细胞培养法

经I型胶原酶消化获取的脂肪细胞，刚接种时细胞质回缩，为小圆球形，呈悬浮状态（图2a）；2～3 h后，有少量细胞贴壁呈小三角形（图2b）；24h后多数细胞贴壁，贴壁细胞伸展变形，呈长梭形或星形；第3天起，细胞生长加速，梭形和不规则形细胞大量增加（图2c）；至第7天，细胞可形成单层汇合，可进行传代。形成单层汇合后，亦有少数细胞自发分化，细胞内出现反光小滴。

图2 单层细胞法培养绵羊肌内前体脂肪细胞（200×）Fig．2Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of monolayer culture method（200×）

2．2 绵羊肌内前体脂肪细胞的传代培养

细胞进行传代培养时，需在显微镜下时刻观察细胞形态变化，待大量细胞形态回缩变圆、个别细胞飘起时（图3），应立即终止消化，以免消化太过，对细胞造成损伤。第1次传代（接种细胞密度1．0×105个／mL）后，前脂肪细胞仍为梭形，均匀分散分布于整个培养瓶底部，其形态、大小一致，增殖迅速。一般2～3d即可形成单层汇合，细胞的形态及其生长情况、脂肪积聚情况基本与原代培养一致。

图3 细胞经胰蛋白酶消化时的形态变化Fig．3Morphology of cells digested by trypsin

2．3 绵羊肌内前体脂肪细胞的生长曲线测定

在接种密度为5×104个／mL条件下，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制出细胞生长曲线。根据司徒镇强等［6］关于培养细胞倍增时间的计算公式，得出绵羊肌内前体脂肪细胞的倍增时间为62h（图4）。从图4可以看出，绵羊肌内前体脂肪细胞生长曲线类似S型，符合体外培养细胞的正常生长增殖规律，即先进入缓慢生长的潜伏期（约38h），随后到指数生长期（第2～6天），最后达到生长停止的平台期（第7天后）。第9天，因细胞密度过大，受营养物质竞争和代谢产物干扰，少数细胞脱落死亡。

图4 肌内前体脂肪细胞生长曲线Fig．4Gowth curve of intramuscular preadipocytes cultured in vitro

2．4 绵羊肌内前体脂肪细胞的诱导分化及油红O染色鉴定

细胞增殖与细胞分化是相互制约的2个过程，前体脂肪细胞在未使用诱导剂前，以增殖为主，而经INS＋DEX＋IBMX诱导后快速进入分化成熟阶段。实验中，诱导分化第2天，有少量细胞内出现数量不等散在的小脂滴；第4天，多脂滴细胞明显增多（图5a）；第8～10天，部分小脂滴开始汇合成大脂滴（图5b）。诱导分化后的细胞，经油红O染色法鉴定，脂滴被亲脂的油红O着色而成橘红色，细胞核被苏木精染成蓝色，证明该细胞是脂肪细胞（图5c）。

图5 脂肪细胞的诱导分化及分化鉴定（200×）Fig．5Induce differentiation and identification of intramuscular preadipocyte

2．5 前体脂肪细胞内脂肪含量测定

测定结果见图6。

由图6可知，前体脂肪细胞经INS＋DEX＋IBMX诱导分化后，于第2天少数细胞内出现散在脂滴；第4天开始，随着诱导分化的进行，细胞内脂肪含量持续增加；脂肪含量的测定结果与诱导后细胞内脂肪形成的形态学变化完全吻合。

图6 前体脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量的变化Fig．6Cytoplasmic fat content changes in preadipocyte differentiation

3 讨论

1）本研究采用组织块法和Ⅰ型胶原酶消化法均获得了成分均一、增殖和分化旺盛的梭形细胞。通过比较，发现2种方法各有优缺点：组织块培养法操作步骤简便、成功率高且细胞同源性好，缺点在于原代培养耗时较长（约15d），得到的细胞数量较少；而I型胶原酶消化法只需5～6d即可达到80%汇合，适于短期内获得大量细胞的实验，其缺点在于有其他种类细胞混杂，污染率较高，但通过严格控制操作可减少污染，通过细胞传代可纯化细胞。故本实验后续培养均采用消化法培养，培养条件与猪［3］、牛［4］、人［8］、大鼠［9］等的前体脂肪细胞培养条件基本一致。另有文献［10］指出，随着不断传代及细胞生存环境的变化，细胞的生物学特性会发生改变，增殖和分化能力会不断下降，故本实验后续研究均采用2代以内的前体脂肪细胞。

结合表5、表6可知碱剂在25 g/L质量浓度是最好的，在碱剂质量浓度25 g/L的情况下，再确定棉条的最佳染色温度。染色温度对染料的吸附有影响，一般染色温度低，染色时间更长，可以提高棉条的染色深度。然而在实际染色中要考虑经济性，所以有必要设定合理的染色温度。本实验通过改变染色温度，研究不同染色温度 （40℃，50℃，60℃，70℃，80℃）对棉条染色深度的影响。染色工艺见表7、实验结果见表8。

2）细胞生长曲线是细胞生长基本规律的重要表现，每一代细胞的生长过程可分为潜伏期、指数生长期、平台期和抑制期。需要注意的是，潜伏期的长短与接种的细胞密度有关，细胞数过少会导致细胞生长缓慢；而细胞密度越大，潜伏期就越短，更导致细胞提早进入生长抑制阶段。本实验通过不断摸索，认为24孔板每孔接种5．0×104个细胞、接种后24h进行首次换液能得到较好的结果。细胞经历38h的潜伏期后，于第2天开始迅速增殖，第7天时增殖速度逐渐下降进入平台期，第9天由于细胞密度增大，代谢产物增加，部分细胞脱落死亡，进入抑制期，其生长曲线近似S型，符合细胞的正常生长增殖规律。

3）本实验中的脂肪组织来源于成年雌性绵羊的肌肉内，分离得到的前体脂肪细胞在胰岛素和地塞米松的诱导下能分化为成熟脂肪细胞，说明在成年动物中确实存在具有分化能力的前体脂肪细胞，这与Yagi等［11］的结果相一致等。原代培养中，在不外加胰岛素和地塞米松的情况下，发现少部分细胞能自动分化为成熟脂肪细胞，而在传代培养中则必须有胰岛素和地塞米松的诱导。这可能是因为本研究中的脂肪块来源于成年个体的成熟脂肪组织，前脂肪细胞在体内已经被激活，或是本身分离获得的前脂肪细胞中就存在一定数量的成熟脂肪细胞，故可观察到这种活跃的脂肪细胞新生。

在当前时代背景下，各行各业的发展都离不开制度的规范，我国土木工程行业也不例外，对于土木工程施工管理工作，施工管理制度可以为土木工程项目的整体施工质量管理工作提供基础保障，因此，只有在健全的管理制度下，才能保证管理工作的顺利进行。但就我国目前土木工程施工管理工作的实际情况，大部分施工单位都在应用传统的管理制度以及管理规范，由于这些管理制度的落后，无法满足当前管理工作的实际需要，且内容不够全面，对工程管理工作中的一些细节无法进行系统管理，对现场施工工作的顺利进行起到了阻碍作用。

4）油红O是一种能与细胞内甘油三酯特异性结合而使其着橘红色的染料，其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似，因此常用作体外培养前脂肪细胞的鉴定、分化状态的观察和分化程度的定量分析［12］。本实验结果表明，原代培养细胞在80%汇合后、传代细胞经诱导后，胞浆内逐渐出现反光小滴，经油红O染色后呈红色，证实所培养细胞为脂肪细胞。而且，细胞在诱导培养2d后开始有脂肪积聚，4d后积聚量迅速增加，与诱导后细胞内脂肪形成的形态学变化完全吻合。

综上所述，通过一系列的实验结果和研究分析证明，本研究成功建立了绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养模式，探索了其生长、增殖及分化的生物学特征，可为后续开展绵羊肌内脂肪发育与沉积机制及改善羊肉品质和风味等研究奠定基础。

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