玉米浆对Vc二步发酵产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

牛建双，吕淑霞，赵朔，林英，马镝，刘鹏举

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866)

维生素C，又名L-抗坏血酸，是人体营养所必需的水溶性维生素［1］。尹光琳等［2］发明了Vc二步发酵法，主要利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)俗称小菌和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)俗称大菌混合菌体系，将L-山梨糖转化为Vc的前体2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-gulonic acid，2-KLG)，并应用于Vc的工业生产。目前对混合菌发酵体系中大、小菌关系比较明确的认识是:大菌单独培养容易，本身不产酸;小菌可将L-山梨糖转化为Vc前体2-KGA［3］，小菌单独培养不产酸，单独培养传代存活率及产2-KLG能力均较低［4］，但是大、小菌的确切作用机制尚不清楚，对此方面研究也相对较少［5］。前人多从大菌分泌的胞外活性物质入手，研究大、小菌的关系，操作较复杂。玉米浆是发酵培养基的成分之一，以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得［6］，其构成成分较复杂。玉米浆中富含大量的糖类、可溶性蛋白质、氨基酸、多肽、脂肪酸、维生素、肌醇、水解酶、其他有机化合物、重金属和无机离子。由于富含可溶性蛋白和多种游离氨基酸，是微生物发酵的良好氮源［7］。王绍萍等［8］经高效液相色谱检出玉米浆中含有谷氨酸等12种氨基酸。目前，在Vc二步发酵研究中，玉米浆作为发酵培养基的成分之一，和其他成分一起进行湿热灭菌，还未有报道将其用0.22 μm滤膜过滤除菌后再加入灭过菌的其他培养基成分。过滤除菌避免了湿热灭菌的弊端，可以使玉米浆中的活性物质不被高温高压破坏。本文抛开大菌，从培养基成分玉米浆入手，添加不同量的过滤除菌玉米浆，初步研究其对小菌产酸及生长的影响，初步研究了玉米浆中主要的12种氨基酸对小菌产酸的影响，为Vc二步发酵法的研究提供了一个新的切入点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)，由东北制药总厂提供。

1.1.2 培养基①种子培养基(%):山梨糖2.0，葡萄糖0.2，尿素0.1，玉米浆0.5，碳酸钙0.1;②发酵培养基(%):山梨糖8.0，尿素1.2，KH2PO40.1，MgSO40.02，10×10－6FeSO40.1 mL/L，碳酸钙0.5。各种培养基均以30%NaOH调节pH为6.7～7.0，121℃灭菌30 min［9］。

1.2 方法

1.2.1 培养方法种子培养和发酵分别在28℃，180 r/min振荡培养24 h和72 h［10］。

1.2.2 玉米浆的过滤除菌分别取1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 g玉米浆溶于20 mL蒸馏水，30%NaOH调节pH为6.7～7.0，8 000 r/min离心5 min，取上清，以0.22 μm滤膜过滤除菌，分别与灭好菌的发酵培养基其他成分混合。

1.2.3 2-酮基-L-古龙酸含量测定吸取2 mL发酵液样品于试管中，加入2 mL 7 mol/L浓H2SO4摇匀。100℃沸水浴中煮沸30 min，自来水冷却后加入250 mL三角瓶中，以1%淀粉溶液作指示剂(用量约为3 mL/100 mL)，用0.05 mol/L的I2溶液滴定至蓝色为反应终点。按如下公式计算2-KGA的生成量。

M为I2溶液浓度(0.05 mol/L×2);V为0.05 mol/L I2溶液消耗的体积(mL);A为2-KLG转化为Vc的转化率(%)(以63.10%计算);B为所取发酵液毫升数(2 mL);0.907 2为Vc分子量/2-KLG分子量;0.088 06为每毫升0.05 mol/L碘液相当8.806 mg Vc［11］。

1.2.4 小菌活菌数测定平板菌落计数法计算活菌数，将发酵液稀释至10－7～10－9，然后取0.1 mL均匀涂布在分离培养基上，48 h后计算活菌数［12］。

2 结果与分析

2.1 玉米浆含量对小菌发酵的影响

按照10%接种量将小菌种子接入不同玉米浆含量发酵培养基中，29℃，180 r/min摇床培养72 h。碘量法测定2-KLG含量，并检测发酵液中小菌活菌数，结果见表1。从表1可以看出，玉米浆含量2.5 g/100 mL左右时，2-KLG产量达最大值，为26.84 mg/mL，发酵液中小菌活菌数达到8.18×109cfu/mL，为不添加过滤除菌玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。玉米浆浓度增加到3 g/100 mL时，2-KLG产量开始下降。培养体系营养增加，利于菌体生长繁殖，使发酵液中菌体浓度增加，产酸量增加。但加入玉米浆过多时，菌体生长过于旺盛，使得用于产生菌体的山梨糖用量增加，使产酸量下降。因此玉米浆的添加量为2.5 g/100 mL。

表1 发酵培养基中玉米浆添加量对产酸菌的影响Table 1 Effects of corn steep liquor content in fermentation medium on G.oxydans

2.2 玉米浆中氨基酸对小菌发酵的影响

未含玉米浆成分的发酵培养基中氨基酸加入量为0.5 g/L和2.0 g/L。表2为添加12种氨基酸对小菌发酵产酸影响。从表2可以看出，12种氨基酸分别与小菌培养，及混合后与小菌培养，都不能促进小菌产酸及生长。玉米浆中还含有多种维生素等生长因子，这些维生素等作为生长因子对微生物发酵也会产生影响。玉米浆中其他成分对小菌产酸的影响还待研究。

表2 发酵培养基中氨基酸对产酸菌的影响Table 2 Effects of Amino acid in fermentation medium on G.oxydans

3 结论

Vc二步发酵培养基中过滤除菌玉米浆的加入影响了小菌单独发酵产2-KLG的量以及小菌活菌数。当加入玉米浆含量提高时，小菌发酵产2-KLG量提高，小菌活菌数增多。当加入玉米浆为2.5 g/100 mL左右时，产酸量最高是小菌单独发酵产酸的10.48倍，菌体含量是不添加玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。随玉米浆加入的提高，菌体数量生长消耗山梨糖增加，产酸量下降。所以发酵过程选择最适玉米浆含量为2.5 g/100 mL。玉米浆成分中12种氨基酸的加入未对小菌产酸产生促进作用。玉米浆中其他成分对小菌产酸的促进作用还有待进一步研究。由于玉米浆生产成本低，又可对Vc二步发酵中小菌产酸及生长起到显著促进作用，所以玉米浆对小菌产酸的促进作用值得进一步研究，这为Vc二步发酵中大小菌伴生机制研究提供了一个新的切入点。

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