高效液相色谱法测定辣椒中的辣椒碱和二氢辣椒碱

谷 岩 刘广福 黄 旭 陈晓迪 祝 旭

(辽宁省产品质量监督检验院，沈阳 110004)

白树田

(辽宁省北票市质量技术监督局，辽宁北票 122000)

高效液相色谱法测定辣椒中的辣椒碱和二氢辣椒碱

谷 岩 刘广福 黄 旭 陈晓迪 祝 旭

(辽宁省产品质量监督检验院，沈阳 110004)

白树田

(辽宁省北票市质量技术监督局，辽宁北票 122000)

建立了高效液相色谱法(HPLC)测定辣椒中辣椒碱、二氢辣椒碱的检测方法。实验考察了仪器条件、不同流动相体系、流动相配比、柱温、流速等因素对分离的影响。确定了最佳色谱条件为ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；二极管阵列检测器，辣椒碱、二氢辣椒碱的最佳检测波长为280 nm；色谱柱温度为20℃；最佳流动相配比为水-甲醇(体积比为35∶65)，流速为1.0 mL／min；进样量为5 μL。在最佳色谱条件下，建立了辣椒碱的标准曲线，相关系数r=0.999 9。辣椒碱、二氢辣椒碱的加标回收率分别为94.1%～96.8%、92.6%～95.0%，测定结果的相对标准偏差小于2.0%（n=11）。该法实现了25 min内对辣椒碱、二氢辣椒碱的同时测定。

高效液相色谱 辣椒碱 二氢辣椒碱

辣椒碱又名辣素［1］，其化学名称为8-甲基-N-［(4-羟基-3-甲氧基苯基］-(反)-6-壬烯基酰胺，是从天然植物辣椒中提炼而制得的，其纯品为白色晶体［2］，熔点为65℃，几乎不溶于冷水，易溶于乙醇、丙酮等溶剂中。由于辣椒碱来源于纯天然，而且药理活性特殊，国外开发应用的时间较长，在生物农药中的新用途不断被开发，其市场发展前景相当广阔。我国辣椒碱的生产应用尚处于起步阶段，产品以出口为主。由于在国内还未实现在医药、农药等领域中的大量应用，因此目前仅限于少量的低浓度产品应用于高档食品添加剂领域，其余大部分产品出口到日本、韩国、美国等国家。各种辣椒深加工产品由于要求不同，往往采用的分析方法也不同，这使得结果差异很大。辣椒碱含量的常用测定方法有可见分光光度法［3］、亚硝酸钠比色法［4］、FAO 紫外双比色法［4］、高效液相色谱法［5］等。

为了促进辣椒深加工制品的生产，依托辽宁省北票地区辣椒产业优势并结合当地产业链，提升加工能力，提高产品附加值，促进当地辣椒产业健康发展，笔者研究了高效液相色谱测定辣椒中辣椒碱、二氢辣椒碱的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent HPLC 1200型，配有四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二级管阵列检测器，美国Agilent公司；

二氧化碳萃取仪：ASI型，中国环球分析测试仪器有限公司；

美国密理博纯水设备：Simplicity型，美国密理博公司；

甲醇：色谱纯；

辣椒碱、二氢辣椒碱标准样品：纯度不小于98%，北京百灵威科技有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

辣椒碱、二氢辣椒碱标准储备液：200 μg／mL，分别称取10.00 mg的辣椒碱和二氢辣椒碱(按产品标明的纯度折算成纯标物)，用少量甲醇溶解后，转移至50 mL容量瓶中，定容，混匀。

蒸馏水：实验室自备。

1.2 样品制备

称取不小于100 g的成熟干红辣椒，在95～100℃条件下干燥至恒重，使水分含量低于0.5%，粉碎，均过420 μm(40目)分析筛，装入干燥的玻璃磨口瓶中备用。样品质量5 g、夹带剂为无水乙醇7 mL、萃取温度40℃、萃取压力12 MPa、萃取时间 1～1.5 h。

1.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；椒碱、二氢辣椒碱检测波长：280 nm；流动相：35%水-65%甲醇；流速：1.0 mL／min；柱温：20℃；进样量：5 μL。

采用1.2方法进行样品前处理，按上述色谱条件进行分析得辣椒碱、二氢辣椒碱标准样品色谱图见图1，实际样品色谱图见图2。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

在高效液相色谱分析中，流动相的恰当选择对改善分离效果能起到重要的辅助作用。从实用角度考虑，选用作为流动相的溶剂应当容易购得，使用安全，纯度级别高。因此本实验采用水-甲醇为流动相体系。

实验考察了80%水-20%甲醇、50%水-50%甲醇、35%水-65%甲醇、20%水-80%甲醇4中不同比例的流动相。当流动相为80%水-20%甲醇时，辣椒碱与二氢辣椒碱几乎分离不开，随着流动相中水比例的下降，甲醇含量的增加，辣椒碱与二氢辣椒碱的分离度也逐渐增加，当甲醇含量达到65%时，分离度良好，色谱峰不拖尾，因此实验选用35%水-65%甲醇为流动相。

2.2 检测波长的选择

通过紫外可见分光光度计全波长扫描，发现辣椒碱和二氢辣椒碱在可见光区都无较大吸收，当波长为280 nm时，测定组分有较大吸收，因此本实验选择280 nm为辣椒碱和二氢辣椒碱的吸收波长。

2.3 柱温的选择

柱温是影响分离度及分析时间的因素之一。一般情况下，温度升高，可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高对分离选择性有一定的影响，且使流动相易产生气泡。实验表明，随着柱温的升高，组分保留时间变短。随温度变化后两个组分间的分离度都远大于1.5，保留时间差足够大，不影响分离度。但在15℃下二氢辣椒碱保留时间较长，随着温度的升高，各组分保留时间无明显变化，但柱温过高，对色谱柱的寿命有影响，因此实验选择20℃的柱温。

2.4 流动相流速的选择

流速对保留时间有一定的影响。流速太低，影响分析的速度；流速过大，系统的压力太高，容易冲塌柱。实验发现，在流速为1.0 mL／min时，进样开始时的柱压已达到15.2 MPa，而该色谱柱允许的最大使用压力为20 MPa；当流速为0.6～1.0 mL／min时，各组分保留时间相当而且都达到了基线分离。综合考虑分离度、分析效率及色谱柱柱压情况，实验选择最佳流速为1.0 mL／min。

2.5 进样量的选择

在液相色谱中，进样量是影响检测器灵敏度的关键因素之一。此外，进样量的大小还会影响色谱峰的峰宽、峰形，严重时甚至影响到分离。当进样量太低时，辣椒碱的灵敏度下降，当进样量为10 μL时，二氢辣椒碱已经发生拖尾。综合考虑，实验选择5 μL为最佳进样量。

2.6 回归方程及相关系数

移取浓度为200 mg／L的辣椒碱、二氢辣椒碱的标准储备液 0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇 匀，配 制 成 2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100 mg／L的系列标准溶液，按最佳色谱条件进样分析。分别对辣椒碱、二氢辣椒碱浓度x与对应的峰面积y进行线性回归，得到线性回归方程、相关系数见表1。

表1 标准曲线的回归方程及相关系数

由表1可以看出，辣椒碱、二氢辣椒碱的线性关系良好，相关系数均为0.999 9，可以满足日常分析要求。

2.7 准确度与精密度试验

在确定的最佳色谱条件下，平行测定辣椒样品11批次，结果见表2。

表2 精密度试验结果

由表2可知，该方法的精密度良好，辣椒碱和二氢辣椒碱的相对标准偏差均小于2.0%，满足分析要求。

在辣椒样品中分别添加3个水平浓度标准溶液，按实验方法进行回收试验，结果见表3。由表3可知，辣椒碱和二氢辣椒碱的回收率分别为94.1%～96.8%、92.6%～95.0%，说明方法的准确度较高。

表3 回收试验结果(n=11)

3 结语

采用高效液相色谱法测定辣椒中辣椒碱、二氢辣椒碱。结果表明，所建立的方法具有快速、经济、灵敏、准确等特点，在北票辣椒基地辣椒制品的检测中应用，结果令人满意。

［1］董汝晶，谯顺彬.辣椒产业的研究现状及发展趋势［J］.中国调味品，2009.10(34)： 32-36.

［2］Feng J N，Fu J，Han M L. Research summarizationon capsaicin［J］.Acta Agric Borea Sin，2005，141： 84-87.

［3］杨雅婷，李天俊，丛方地,等.辣椒碱制备及测定方法的研究进展［J］.行业综述，2008，20(6)： 14-18.

［4］Nikolaeva D A. Use of aspectrophoto metricmethod for the quantativedeter mination of capsaicininpepper breading by chemicalcomposition［J］. Chemical Abstract，1983,99： 19097C.

DETERMINATION OF CAPSAICIN AND DIHYDROCAPSAICIN IN PEPPER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Gu Yan， Liu Guangfu， Huang Xu， Chen Xiaodi， Zhu Xu
(Liaoning Province Product Quality Supervision and Inspection Center ， Shenyang 110004， China)

Bai Shutian
(Liaoning Province Beipiao City Quality and Technical Supervision Bureau ， Beipiao 122000， China)

A method to determine capsaicin and dihydrocapsaicin in pepper products simultaneously by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. The effects of mobile phase composition，proportion，column temperature，velocity of flow and injection volume on separation were studied. The best chromatographic conditions were determined： a ZORBAX SB C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；a DAD detector； the optimal detection wavelengths of capsaicin and dihydrocapsaicin were 280 nm；the column temperature was 20℃ . The mobile phase was water-methanol(Volume ratio was 35∶65) with flow rate of 1.0 mL／min ；the injection volume was 5 μL. Under the optimal conditions，calibration curves of each substitutes were established，and the related coefficients were 0.999 9. The recoveries of capsaicin and dihydrocapsaicin in samples were 94.1%-96.8%, 92.6%-95.0% respectively. The RSD was less than 2%(n=11). The method has achieved the simultaneous determination on capsaicin and dihydrocapsaicin in 25 minutes.

HPLC，capsaicin，dihydrocapsaicin

2011-08-12