小凹蛋白－1和细胞外钙敏感受体在人脐静脉内皮细胞小凹共定位研究

龚 艳，胡清华，钟 华，梁 霄，罗小林，何 芳

（1石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；2华中科技大学同济医学院／卫生部呼吸系疾病重点实验室，武汉430030）

小凹蛋白－1和细胞外钙敏感受体在人脐静脉内皮细胞小凹共定位研究

龚 艳1，胡清华2，钟 华1，梁 霄1，罗小林1，何 芳1

（1石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；2华中科技大学同济医学院／卫生部呼吸系疾病重点实验室，武汉430030）

前期研究发现小凹蛋白－1（caveolin－1，Cav－1）和细胞外钙敏感受体（extracellular Ca2＋－sensing receptor，Ca R）在人脐静脉内皮细胞（hu man u mbilical vein endothelial cells，HUVECs）膜上有共定位，且Cav－1下调Ca R介导的钙内流。本实验探讨HUVECs中Cav－1与Ca R的亚细胞定位，可为进一步机制研究提供理论依据。以3～4代HUVECs随机分为2组：（1）对照组；（2）甲基－β－环糊精（MβCD）处理组，分别采用蔗糖密度梯度离心和 Western blot技术提取含小凹膜碎片和检测Cav－1和Ca R蛋白的表达。结果显示，（1）MβCD处理组HUVECs细胞中Cav－1和Ca R蛋白的表达与对照组相比无差异（P＞0.05）。（2）MβCD处理组小凹区Cav－1和Ca R蛋白的表达低于对照组（P＜0.05）。由此可知，Cav－1和Ca R蛋白共定位于HUVECs的小凹区，MβCD可抑制两者在小凹的共定位。

蔗糖密度梯度离心；甲基－β－环糊精；小凹蛋白－1；细胞外钙敏感受体

血管内皮细胞持续钙离子内流以维持细胞内钙离子浓度是细胞执行功能所必须的。细胞外钙敏感受体（Extracellular Ca2＋－sensing Receptor，Ca R）是调节细胞内钙离子浓度的重要受体蛋白，属于G蛋白偶联受体超家族中C亚族的成员，其基本结构与一般G蛋白偶联受体相同，在维持全身钙稳态和调节血管张力方面起着重要的作用。小凹蛋白－1（Caveolin－1，Cav－1）是小凹（Caveolae）表面的标志蛋白和结构蛋白，已在人脐静脉内皮细胞（Hu man Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）证实Ca R和Cav－1共定位于胞膜，且Cav－1对Ca R介导的钙内流有下调作用［1－2］。为进一步探讨其机制，本研究拟在现有工作基础上，分别采用蔗糖密度梯度离心法和 Western blot技术提取含Cav－1膜碎片（即Caveolae）和检测Cav－1 Ca R蛋白在HUVECs的亚细胞定位。

1 材料与方法

1.1 材料

健康孕妇剖宫产的新鲜脐带，性别、体重不限（来自华中科技大学同济医学院附属同济医院，经伦理道德委员会批准和个人知情同意）；甲基－β－环糊精（methyl－β－cyelodextrin，MβCD）（Sig ma）；抑肽酶（Aprotinin）（Sig ma）；M199（Ther mo）；ECM（Sciencellg）；胎牛血清（Gibco）；明胶（Sig ma）；Cocktail（CALBIOCHEM 公 司）；Cav－1 一 抗 （cell signaling）；Ca R 一 抗 （Affinity Bio Reagents，ABR）；GAPDH（博 奥 森）；HRP Conjugated Goat anti－Mouse Ig G h＋1（Invitrogen公司）；HRP Conj ugated Goat anti－Rabbit Ig G h＋1（Invitr ogen公司）；ECL发光试剂盒（Ther mo）；其余均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs原代培养

依据本研究室以前的方法培养HUVEC［1］，并对其进行细胞形态学及对细胞内Ⅷ因子进行免疫细胞化学染色鉴定是否为HUVEC。取2～5代细胞用于实验。

1.2.2 Western blot检测 MβCD处理后 HUVECs中Cav－1和CaR蛋白表达

正常细胞和用MβCD预孵育30 min后的HUVECs，分别弃去培养基，用预冷的PBS冲洗2～3遍后，加入含有Cocktail的裂解液，细胞刮刀刮下贴壁细胞，将黏稠状细胞裂解产物收集于eppendorf管中。冰浴中静置30 min～60 min，12 000 r／min，4℃，离心5 min。将上清移入另一eppendorf管中，弃去沉淀。BCA方法蛋白定量。样品加入加样缓冲液，沸水煮5 min，SDS－PAGE电泳分离蛋白，电转至醋酸纤维素膜（NC膜）上，室温下用5%脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h。分别加入Cav－1的一抗和Ca R的一抗，4℃冰箱孵育过夜。次日用TBST洗膜3次各15 min，加入相应的二抗摇床上孵育1 h，TBST洗膜3次各20 min；ECL化学发光试剂显色，显影定影，获得实验结果。

1.2.3 蔗糖密度梯度离心法提取Caveolae并检测Cav－1与Ca R蛋白在Caveolae表达及两者共定位

非连续蔗糖密度梯度离心法用于制备含Caveolae膜碎片［3－4］，所有步骤均在冰上操作。收集约5×107个细胞，用1 ml裂解缓冲液悬浮，裂解缓冲液成分：1%Triton X－100，5 mmol／L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA），1 mmol／L MNa3VO4，1 mmol／L 氟代 甲烷苯磺酸，75 U抑肽酶；实验中用Caveolae结构破坏剂2 mmol／L MβCD 处理细胞［5］，细胞超声破碎仪破碎细胞2 s、5次，将细胞裂解物与相同体积的85%蔗糖混合，放入离心管底部，依次加入45%，30%，20%，10%，5%的蔗糖溶液，4℃，超速离心200 000 g，18 h，依次吸出离心条带，每次1 mL，共可获得12个样本，其中从上往下第6个样本为白色絮状的分层，取出的各区段样本经SDS－PAGE电泳，用Wester n blot检测Caveolae的标志蛋白Cav－1及是否与Ca R共定位与同一Caveolae区。

1.2.4 统计学处理

实验数据用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，均数间的比较采用t检验。所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理方法后HUVECs中Cav－1和Ca R蛋白表达

用MβCD预孵育HUVECs 30 min后提蛋白，Wester n blot检测Ca R及Cav－1蛋白表达的结果见图1a。其中Ca R蛋白表达在对照组与MβCD处理组分别为0.77±0.01，0.75±0.01；Cav－1分别为1.88±0.01和1.84±0.01，两组间 Ca R 和 Cav－1蛋白表达均无差异（P＞0.05）（图1b）。

图1 不同处理组HUVECs中Cav－1和CaR蛋白的表达Fig.1 The expression of Cav－1 protein and Ca R protein in HUVECs

2.2 蔗糖梯度密度离心法提Caveolae后Western blot检测Cav－1和Ca R蛋白表达及两者共定位

细胞裂解物经蔗糖密度梯度离心后用无菌注射器按体积共抽取12个样本，在离心管中间，20%与30%蔗糖浓度交界处出现一个白色絮状物的分层，此白色絮状分层在第6个样本区，并在此样本中采用Western blot技术检测到Caveolae的标志蛋白Cav－1，同时也检测到Ca R的表达（图2a）；其中Ca R蛋白表达在第6个样本对照组与MβCD处理组分别为1和0.57±0.03；Cav－1分别为1和0.69±0.04，MβCD处理组Ca R和Cav－1蛋白表达均低于对照组（P＜0.05）（图2b）。

图2 不同处理组第6个样本Cav－1和CaR蛋白的表达水平Fig.2 The expression of Cav－1 protein and Ca R protein in No.6

3 讨论

Ca2＋是细胞内重要的信号转导成分，在神经肌肉兴奋、细胞生长分化等过程中发挥重要作用。Ca R是介导内Ca2＋释放和外Ca2＋内流的受体之一，其作用可由G蛋白α亚基介导，但也与Ca R相互作用的蛋白有关，Cav－1是与Ca R相互作用的蛋白之一［6］，在某些组织或细胞证实了Cav－1通过与Ca R或其它钙通道蛋白相互作用在调节Ca2＋内流中发挥重要作用。Jung等［7］在培养的人骨肉瘤细胞株（Saos－2）证实Ca R和Cav－1形成复合物并共定位于胞膜，Cav－1可调节Ca R的功能。本课题组前期研究发现在HUVECs有Ca R和Cav－1表达，用免疫荧光技术检测在HUVECs中Cav－1和Ca R共定位于胞膜，Cav－1对Ca R介导的Ca2＋内流有下调作用［1－2］，其机制尚不清楚。

Caveolae是细胞表面特异性内陷结构，是细胞信号传导中心，与信号传导有关的受体、激酶等在Caveolae区域高度富集［8］，而 Cav－1又是 Caveolae的表面标志蛋白和结构蛋白，我们设想在HUVECs中Ca R与Cav－1在共定位于Caveolae区可能是Cav－1下调Ca R功能的机制之一。，为初步验证此假设，在本研究中，首先采用蔗糖密度梯度离心的方法处理细胞，最后每组收集到12个样本，其中从上往下第6个样本为白色絮状分层，在第6个样本区检测到高表达的Caveolae标志蛋白Cav－1，证实为Caveolae所在区域，同时Ca R此样本中也有较高表达，说明Cav－1和Ca R共定位于同一Caveolae区；而用Caveolae结构破坏剂MβCD处理细胞（胆固醇和磷脂是Caveolae发挥重要功能的脂质成分，MβCD能破坏胆固醇和磷脂，从而影响Caveolae功能，但对细胞膜的完整性无影响）后发现，Cav－1和Ca R的在HUVECs中表达没有改变，但在Caveolae区两者的表达均降低。该结果提示MβCD处理破坏Caveolaee结构，并不影响Ca R与Cav－1蛋白的表达水平，Cav－1可能是Ca R定位于Caveolae区重要的调节蛋白。Cav－1并非是很强的可调节蛋白［4］，Cav－1的表达直接与膜上Caveolae数目相关，所以MβCD可能是通过破坏胆固醇和磷脂，减少了细胞膜上Caveolae的数目使Cav－1的表达降低，从而抑制了两者在同一Caveolae区的共定位。

总之，我们研究初步证实Ca R与Cav－1蛋白共定位于同一Caveolae区，MβCD。在抑制Cav－1表达的同时可影响Ca R和Cav－1亚细胞定位，两蛋白其它功能上的联系还有待进一步探查，该研究结果不仅对深入了解在血管系统中Cav－1调节Ca R功能的生理和病理生理作用机制有重要意义，还能为临床疾病防治提供一条新思路。

［1］王振焕，钟华，何芳，等.小凹蛋白－1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达［J］.石河子大学学报：自然科学版，2010，28（2）：194－198.

［2］王振焕，胡清华，何芳，等.小凹蛋白－1下调人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流［J］.生理学报，2011，63（1）：39－47

［3］Ledes ma M D，Abad－Rodriguez J，Galvan C，et al.Raft disor ganization leads to reduced plasmin activity in Alzhei mer’S disease brains［J］.EMBO Rep，2003，4（12）：1190－1196.

［4］Meye C，Schumann J，Wagner A，et al.Effects of homocysteine on the levels of caveolin－1 and e NOS incaveolae of hu man coronary artery endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2007，190（2）：256－263.

［5］Fehx E，Tho mas SN，Leonar d JF，et al.Proteomic analysis of glycosyl phosphat－idylinositol－anchored membrane proteins［J］.Mol Cell Pr oteo mics，2003，2（12）：1261－1270.

［6］Huang C，Miller R T.The calciu m－sensing receptor and its interacting proteins［J］.J Cell Mol Med，2007，11（5）：923－934.

［7］Jung S Y，Kwak J O，Ki m H W，et al.Calciu m sensing receptor for ms complex with and is up－regulated by caveolin－1 in cult ured hu man osteosarco ma （Saos－2）cells［J］.Exp Mol Med，2005，37（2）：91－100.

［8］Liu P，Rudick M，Andson R G.Mutiple f unctions of caveolin－1［J］.J Biol Chem，2002，277（44）：41295－41298.

Co－localization of Caveolin－1 and Extracellular Ca2＋－sensing Receptor in Caveolae in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

GONG Yan1，HU Qinghua2，ZHONG Hua1，LIANG Xiao1，LUO Xiaoling1，HE Fang1
（1 Medical College of Shihezi University／Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi，832002，China；2 Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology／Key Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China，Wuhan 430030，China）

Our previous results demonstrated that extracellular Ca2＋－sensing receptor（Ca R）and caveolin－1（Cav－1）co－localized on the plasma localization of Cav－1 and CaRin HUVECs，which provide a theoretical basis for further functional studies.Methods：The thirdor fourth passage of HUVECs were randomly divided into two groups：（1）Control group；（2）methyl－β－cyelodextrin（MβCD）group.We isolated caveolae－enriched membrane fractions from MβCD－treated HUVECs by Triton X－100 sucrose density gradient fractionation and detected the expressions of Cav－1 and Ca R protein by Wester n blot，respectively.Results：（1）The expression of Cav－1 and Ca R proteins bet ween control group and MβCD group was no difference（P＞0.05）.（2）The expressions of Cav－1 and Ca R proteins in caveolae after MβCD treated was significantly reduced（P＜0.05）.Conclusion：The present st udy suggests that Ca R and Cav－1 co－localize in caveolae in HUVECS，MβCD reduces the co－localization of Cav－1 and Ca R in caveolae.

sucrose density gradient centrifugation；MβCD；caveolin－1；extracellular Ca2＋－sensing receptor

何芳（1964－），女，教授，主要从事心血管病理生理研究；e－mail：fangf2002shz＠126.co m。

R363.2＋1

A

1007－7383（2011）03－0305－04

2011－01－20

国家自然科学基金项目（30860099）

龚艳（1985－），女，硕士生，专业方向为心血管病理生理。