医用脲酶菌的固定化比较研究

高 虹，陈 明，郑津辉

（天津师范大学 生命科学学院，天津 300387）

医用脲酶菌的固定化比较研究

高 虹，陈 明，郑津辉

（天津师范大学 生命科学学院，天津 300387）

以聚乙烯醇为载体，分别通过化学法与物理法对医用脲酶菌进行包埋，并比较了2种方法所制备微球的性能及血清尿素清除活性.化学法采用硼酸交联，当调节硼酸p H至6.5时所得固定化微球比未调硼酸p H（4.0）的微球有较高的机械强度及尿素吸收活性；物理法采用冷冻交联，所得微球粒径均一，机械强度较好，冷冻交联微球吸收尿素的活性与未调p H（4.0）的硼酸交联微球接近，而略低于p H 6.5硼酸交联微球.体外尿毒症模拟血清尿素清除试验表明，化学法硼酸（p H 6.5）交联的固定化脲酶菌尿素吸收活性最高，8 h尿素清除率达97%，若经培养液预培养24 h，则尿素吸收活性明显增加，6 h清除率为97.2%.

脲酶菌；尿毒症；口服微球；固定化；聚乙烯醇

尿素是最早被认定的一种尿毒症毒素，它在体内的蓄积会引起一系列中毒症状，临床上一直把尿素作为尿毒症毒素的清除指标.口服吸附剂治疗尿毒症是基于肠胃清除尿毒症毒素的一条新路，尚处于研究阶段.由肝脏产生的尿素有20%将随血流扩散到人体肠道中去，口服尿素的特异性吸附剂后，肠道中尿素将不断被吸附剂吸收，从而间接达到降低尿毒症患者血液中毒素水平的目的.与血液透析和血液灌流相比，口服药物的治疗方法具有价格低廉和使用方便的优点.口服吸附剂如活性碳、氧化淀粉、氧化纤维素等化学物质能吸附肠内氮代谢产物并能有效地治疗尿毒症［1－4］.但由于受吸附容量的限制，需加大使用剂量，且部分吸附剂本身就有毒性或是含铝制剂，因此仍需开发能吸附尿毒症毒素而本身无毒性的吸附剂，越来越多的研究转向生物酶系统［5－10］.由于固定化细胞是天然的多酶系统，保持了酶在细胞内的原始状况，无须辅因子再生，增加了酶的稳定性，因此，活的微生物细胞成为尿毒症毒素较理想的生物吸附剂.加拿大麦吉尔大学人工细胞及人工器官研究中心Chan和Prakash等研究制备了固定化的尿素酶基因工程菌株，通过活菌体自身存在的酶系统在大鼠体内转化尿毒症毒素为细菌自身营养物［11－16］.由于其固定化采用APA（海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠）为包埋材料，而APA微囊机械强度有限，阻止了它的进一步临床应用.

聚乙烯醇具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点，是一种新型的微生物包埋固定化载体.且聚乙烯醇在人体肠道内对人体的毒性极低［17－18］，不被肠道吸收，也不会诱导机体发生突变，作为药物包埋载体对人体是非常安全的.

本研究以聚乙烯醇为载体通过物理法及化学法对前期工作所获得的脲酶菌［19］进行包埋，并测定了固定化脲酶菌体外清除尿素的活性.

1 材料与方法

1.1 菌种

Enterobactergergovia是从尿毒症病人肠道中分离得到的一株脲酶菌，并经紫外线及硫酸二乙酯诱变处理［19］.

1.2 培养基

葡萄糖3 g／L，蛋白胨0.1 g／L，酵母膏0.1 g／L，KH2PO41 g／L，K2HPO40.5 g／L，NaC1 0.5 g／L，尿素6%（体积质量浓度）.

1.3 培养方法

从平板上挑取脲酶菌接种于装有10 m L液体培养基的250 m L三角瓶中，37℃培养48 h，再转入装有50 m L液体培养基的250 m L三角瓶中，扩大增殖24 h，离心洗涤收集菌体，称湿重，再用无菌生理盐水调节细胞到所需体积用于微球包埋.

1.4 脲酶菌的包埋

1.4.1 化学法包埋［20］

具体步骤如下：根据所需浓度称取一定量聚乙烯醇（PVA，平均聚合度2 450±50，醇解度98%～99%）和10 mg海藻酸钠（相对分子质量为198.11）于圆底烧瓶中，加入9 m L蒸馏水，90℃水浴加热溶解后，铝箔纸封口，湿热灭菌.另将1 m L菌悬液（含脲酶菌0.8 g）与上述聚乙烯醇溶液混匀，即包埋菌体量为80 mg／m L PVA溶液.在超净台上用注射器将该混合液滴入体积质量2%CaCl2的饱和硼酸无菌溶液（p H 4.6，或 Na2CO3调p H 至6.8）中，室温磁力搅拌状态下保持24 h，再用无菌生理盐水洗涤微球，4℃湿态保存.

1.4.2 物理法包埋［21］

具体步骤如下：取已灭菌的机油100 mL与1.5 mL司班80，于250 m L无菌三口瓶中电动搅拌混匀.配制体积质量为0.1%海藻酸钠的聚乙烯醇水溶液，90℃水浴加热溶解并灭菌.取2 m L菌悬液（含脲酶菌1.6 g）与18 m L聚乙烯醇水溶液混匀，加入到上述三口瓶中，室温电动搅拌30 min分散.将盛有冰盐浴（碎冰∶盐＝3∶1）的容器置于三口瓶外部，在搅拌的同时快速冷冻三口瓶内所形成的液珠.30 min后，将三口瓶置于－20℃冰箱冷冻24 h.解冻时，将三口瓶放于冰盐浴中，将冰盐浴置于4℃冰箱放置24 h，然后于室温继续解冻.取出用已灭菌洗洁净／生理盐水筛洗微球.4℃湿态保存.

1.5 微球粒径分布测量

分别用18目、20目、40目、60目不锈钢筛对不同大小的微球进行分离.

1.6 微球机械强度的测定

将100个微球放入含10 m L蒸馏水的50 m L三角瓶中，并加入10个玻璃珠，以提高碰撞几率和强度.以150 r／min转速在37℃摇床中振荡，分别于一定时间间隔取出微球，在显微镜下观察微球的破碎情况.

1.7 微球通透性的测定

取5 mL微球，加入到50 mL尿素水溶液（1 mg／mL）的250 mL三角瓶中，于37℃，100 r／min摇床中扩散平衡，每0.5 min取样0.5 m L，采用二乙酰一肟法测定尿素浓度［22］，通过溶液中尿素浓度达到平衡的时间来表示微球的通透性.

1.8 微球体外模拟试验

将上述制备的微球平均分成2份，取其中一份加入到50 m L模拟血清中（向50 m L牛血清中添加尿素50 mg），每隔2 h取样进行尿素转化率测定.

2 结果与分析

本实验以聚乙烯醇为包埋材料，采用硼酸交联及冷冻交联2种方法对脲酶菌进行固定包埋，并比较了这2种方法所制备微球的性能.

2.1 微球粒径分布

2.1.1 硼酸交联微球粒径分布

硼酸交联的微球制备采用液滴法，压缩氮气被输入围于针头外层的同心圆气路，并从接近针头处输出，在针头处形成较大的剪切力，将来自针头的混合液射流切割成细小液滴［20］.随着包埋剂聚乙烯醇浓度增加，其操作难度也随之增加.当聚乙烯醇体积质量为5%及6%时形成20～40目微球较容易，当聚乙烯醇体积质量为7%时形成的微球粒径主要分布在18～20目，当聚乙烯醇体积质量为8%时由于粘度太大，较难形成大小一致且有规则的微球.经一系列不锈钢筛对所制备的微球进行筛选计数后，得到微球粒径的分布图如图1（a）所示.

图1 微球粒径分布Figure 1 Distribution of microsphere diameter

2.1.2 冷冻交联微球粒径分布

冷冻交联的微球制备采用锅包法.锅包法制备的微球粒径大小分布比较均匀，基本集中在20～40目之间，将这些微球计数统计后，得到冷冻交联微球粒径的分布图如图1（b）所示.由图1（b）可以看出，冷冻交联微球粒径大小与聚乙烯醇浓度关系不大.

利用冷冻法制备的微球粒径均一，且聚乙烯醇浓度可以设定得较高，便于提高微球的机械强度.而液滴法制备硼酸交联的微球粒径分布稍宽，聚乙烯醇最大体积质量只能达7%，再高就难以滴制成型.因此，从微球的粒径整齐度考虑，冷冻法更易于操作.

2.2 微球机械强度

2.2.1 硼酸交联微球的机械强度

如图2（a）所示，经Na2CO3调节饱和硼酸溶液p H值到6.5后，形成的微球机械强度大大提高，经8 h机械震荡微球破碎率为2%～3%，8 h～24 h不再有新增破碎；而未调p H值所形成的微球，1～24 h内微球破碎率一直处于上升趋势，24 h时的破碎率最高为18%.未调p H所形成的微球经柠檬酸钠处理后，微球内不溶性的海藻酸钙转变成可溶性的海藻酸钠，微球颜色由白色转变为透明色；经调整p H后所形成的微球，经柠檬酸钠处理以后，微球由白色转变为半透明色，表明其内部交联程度较高.饱和硼酸的p H值为4.0，对脲酶菌也有毒性作用，而且p H值也影响聚乙烯醇的凝胶化作用［23］.据报道，硼酸在p H值大于7时是聚乙烯醇良好的交联剂，在p H值小于5时基本不起交联作用.因此，使用硼酸交联法制备微球时，最佳方法是预调饱和硼酸p H值到6.5～7.0之间，即可减少固定化细胞活性损失，还能增加微球内部交联度.

图2 微球强度测试24 h后的破碎率Figure 2 Breakege ratio of microspheres after 24 h test for mechanical strength

2.2.2 冷冻交联微球的机械强度

黄光琳等［24］通过透射电子显微镜观察体积重量为12%PVA（MW∶1 700）水溶液凝胶化的形成过程：在253 K冷冻12 h时，只出现了固液相分离状况，这时尚无较明显的网孔结构形成；继续冷冻24 h，观察到由相分离所致的网孔由稀疏到紧密，逐渐形成和趋于完善.本实验选择一次冷冻24 h制备PVA微球，在实验浓度范围内，微球机械强度随聚乙烯醇浓度的增大而增大（图2（b））.

影响这种凝胶脆性的最重要因素是解冻条件，一般说来，解冻愈慢，凝胶强度越高.缓慢解冻能够确保样品有足够的时间停留在－5～1℃这一温度区间.在此区间内，未冻结水的数量已经足够PVA分子的运动，从而形成大分子间的缠结，同时在这些类液相的区域中PVA的浓度足够高，可以进行强烈的凝胶化.所以反复冷冻／解冻法比一次冷冻／解冻所得的凝胶强度要高得多.为了避免反复冻融造成细胞死亡率增加，本实验选择只冷冻／解冻一次进行物理交联，与具有相同PVA浓度（如体积质量6%PVA）的硼酸交联微球比较，其机械强度高于未调硼酸p H的微球，而略低于调p H后的硼酸交联微球.因此，在本实验条件下当PVA浓度固定不变时，硼酸（p H6.5）交联法制备的微球具有较高的机械强度.

2.3 微球通透性

2.3.1 硼酸交联微球的通透性

取直径为20～40目的硼酸交联微球进行尿素分子的通透性测试，结果如图3（a）所示.饱和硼酸（p H4.0）交联的微球对尿素分子的通透性在1 min时达扩散平衡；而饱和硼酸（p H 6.5）交联的微球由于交联密度增大，通透平衡时间略有延长，约2～3 min时完全通透.

图3 微球尿素通透性测试Fiugre 3 Test of microsphere permeability to urea

2.3.2 冷冻交联微球的通透性

如图3（b），冷冻交联微球随着聚乙烯醇浓度的增加，尿素达平衡时间略有延长，通透性逐渐降低.其中，体积质量6%PVA为2 min，体积质量8%PVA为2.5 min，体积质量10%PVA为3 min.20～30目与30～40目微球通透性在实验误差范围内无差别.

微球通透性试验表明，化学交联法和物理交联法制备的微球都有较好的尿素通透能力，尿素达到完全通透所需时间最长不超过3 min，完全能够满足使用需要.由于微球通透性与微球交联度是一对互相对立的因素，交联度较高的微球通透性相对较低.因此，综合考虑，在通透性不是极低的情况下，应优先考虑交联度因素，有利提高微球机械强度，以保证固定化脲酶菌不会因微球破裂而泄漏.

2.4 体外模拟试验

取20～40目微球进行尿毒症模拟血清尿素清除试验.结果如图4，硼酸交联微球（质量体积6%PVA）中，p H 4.0的微球10 h尿素清除率为97.4%，p H 6.5的微球8 h尿素清除率为97%.由于包埋过程中菌体用量不宜过高，否则会影响微球的交联度和机械强度，因此，在固定化细胞完成之后，可将微球在培养液中培养24 h以提高微球内部的菌体细胞数量.上述2种微球经过24 h培养液预培养后再进行测试，则尿素清除率都有所提高，p H 4.0的微球8 h尿素清除率为96.8%，p H 6.5的微球6 h尿素清除率为97.2%.p H4.0微球通透性高于p H 6.5微球，尿素清除速度却低于p H 6.5微球，说明p H4.0的硼酸对脲酶菌有所伤害.冷冻交联微球（体积质量8%PVA）的尿素清除率10 h为94.8%，若经培养液预培养后测试，则尿素清除率为8 h 97.4%，与p H 4.0的硼酸交联微球尿素清除率接近，而低于p H 6.5的硼酸交联微球，说明冷冻过程对脲酶菌活力也有一定伤害.

图4 血清尿素清除试验Figure 4 Test for plasma urea removal

3 结论

冷冻法制备的微球粒径均一，且聚乙烯醇浓度可以设定得较高，但由于冷冻、解冻过程容易造成脲酶菌细胞伤亡，若减少冻融次数又会降低聚乙烯醇交联度，降低微球机械强度.因此，综合考虑，硼酸交联法经过预调p H到6.5后，所制备的体积质量为7%PVA的微球机械强度高，细胞活性损失小，微球通透性能够满足需要，尿素清除活性最高，且硼酸交联制备微球过程简单，成本低，应是医用脲酶菌固定化的最佳选择方案.

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Comparative study on immobilizition of urease－producing bacteria used in therapy

GAOHong，CHENMing，ZHENGJinhui

（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Urease－producing bacteria used in therapy were entrapped through chemical and physical methods by use of polyvinyl alcohol as the carrier.The properties and serum urea clearance activities of two sorts of microspheres were compared.Microsphere of chemical cross－linking with boric acid p H 6.5 had higher mechanical strength and urea clearance activity than that with boric acid p H 4.0.The freeze－thawing method was employed for physical cross－linking.Microsphere of physical cross－linking had a uniform diameter distribution and good mechanical strength.Its urea clearance activity was almost equal than microsphere with boric acid p H 4.0，and slightly lower than microsphere with boric acid p H 6.5.The experiment of serum urea clearance in vitro showed that microsphere of chemical cross－linking with boric acid p H 6.5 had the highest urea clearance rate of 97%in 8 h.Urea clearance rate was evidently increased to 97.2%in 6 h if pre－culture of the microsphere was carried out for 24 h.

urease－producing bacteria；uremia；oral microsphere；immobilization；PVA

Q939.9；Q 814.2

A

1671－1114（2011）01－0066－05

2010－09－18

天津师范大学青年基金资助项目（52LE39）

高 虹（1965－），女，博士，主要从事生物技术方向的研究.E－mail：gaohong 126＠126.com

（责任编校 纪翠荣）