灰绿黄堇提取物对粘虫的生物活性研究

付艳红,刘敏艳,胡冠芳,李玉奇

(1.甘肃农业大学草业学院农药学系,甘肃兰州 730070;2.甘肃省农业科学院植物保护研究所,甘肃兰州 730070)

灰绿黄堇(Corydalis adunca)属罂粟科紫堇属植物,为我国特有,分布于新疆、内蒙古大青山以西和西北各省的干旱山地草原或荒漠草原地区。王继生等[1-2]发现灰绿黄堇水提物镇痛抗炎的有效成分为灰绿黄堇总生物碱[3]。唐艳丽等[4-5]报道了9个生物碱;随后,梁俊玉等[6]又分离出紫堇碱和去氢紫堇碱。国内开展了灰绿黄堇的药理活性和毒性研究[7],而在杀虫活性研究方面国内外迄今未见文献报道。植物源农药在农作物病虫害防治中具有对环境友好、毒性普遍较低、病虫害不易产生抗药性等优点,是生产无公害农产品应优先选用的农药品种。目前我国尚未见有利用灰绿黄堇生物碱研制的植物源农药的登记。鉴于此,本研究分析了灰绿黄瑾提取物对粘虫的杀虫活性和作用方式,旨在为利用灰绿黄堇开发新型植物源杀虫剂提供线索和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物材料 灰绿黄堇盛花期全株(根、茎、叶、花)采自甘肃省兰州市榆中县。洗净后在室内阴干,粉碎过40目筛,在室温下保存备用。

1.1.2 供试虫源 粘虫(Mythimna separate)采自兰州市榆中县良种繁殖场小麦田,室内用玉米(Zea mays)叶或小麦(Triticum aestivum)苗连续饲养供试。

1.1.3 供试溶剂 甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、氯仿,均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 植物样品的提取 采用冷浸渍法提取[8-9]。称取植物样品50 g,置于棕色广口瓶中,分别加入500 mL不同溶剂浸泡72 h,过滤后收集滤液;滤渣继续用500 mL溶剂浸泡48 h,过滤后收集滤液;滤渣再用500 mL溶剂浸泡24 h,过滤后收集滤液,弃除残渣,合并 3次滤液。滤液经 RE-52AA型旋转蒸发仪减压浓缩至干为粗提物,称其质量,计算产出率。用甲醇溶解并定容至50 mL,相当于干样品1 000 g/L的质量浓度,在冰箱中4℃下保存备用。生物测定前加入1%的表面活性剂JFC(C7～C9烷醇聚氧乙烯醚)。

1.2.2 提取物的萃取分离 2 000 g灰绿黄堇盛花期全株的甲醇粗提物用4 000 g自来水加热搅拌溶解(温度40℃),分别用1 500 mL石油醚、1 500 mL乙酸乙酯和1 000 mL氯仿萃取3次,合并3次萃取液。分别将石油醚、乙酸乙酯、氯仿萃取液以及最终水液浓缩得浸膏,配制成与粗提物相同的浓度,在冰箱中4℃下保存备用。生物测定前加入1%的表面活性剂JFC。以几率值分析法求毒力回归方程y=a+bx、致死中质量浓度及其95%置信限。

1.2.3 生物活性测定方法 触杀作用的测定:采用虫体浸渍法[10-11]。提取物用水稀释成5倍液,剂量相当于干粉200 g/L。挑选大小一致的粘虫3龄初期幼虫,在药液中浸渍5 s,取出后用滤纸吸去多余药液,然后放入直径12 cm铺有滤纸保湿的培养皿中,饲喂新鲜玉米叶片。每处理50头幼虫,重复4次。以甲醇+JFC用水稀释成5倍液浸渍处理作为对照。在温度(25±1)℃、湿度60%～80%、光照时间光∶暗=14∶10条件下饲养,视取食情况及时添加玉米叶片。24 h后调查死亡数,计算死亡率和校正死亡率。

生长发育抑制作用的测定:采用夹毒叶碟法[12]。将玉米叶片剪成6 cm×4 cm的叶碟,用移液管吸取2 mL萃取物原液均匀涂抹于叶蝶正面,待溶剂挥发后,用自制的淀粉浆糊粘上另一片同样大小的叶蝶,制成夹毒叶碟。然后放入直径9 cm铺有保湿滤纸的培养皿中,每皿放1头饥饿4 h并已称量的粘虫3龄幼虫(体质量控制在0.15 g以下),累计处理60头幼虫,以甲醇+JFC原液处理叶蝶作为对照。饲养条件同上。待试虫取食完夹毒叶碟后,更换新鲜的夹毒叶碟,3 d后分别称量幼虫体质量,并更换新鲜无毒叶片继续饲养。以后逐日称量幼虫体质量,至幼虫体质量不再增加时为止。根据幼虫体质量增长情况计算生长发育抑制率。计算公式如下:

胃毒作用的测定:采用夹毒叶碟法[12]。3次重复,每次重复20头;饲养条件同上。测定期间逐日观察记载幼虫死亡数、化蛹数、不正常羽化数,求出死亡率及校正死亡率。

1.3 数据处理方法 利用SPSS软件中ANOVA方法对试验数据进行方差分析,并用Duncan's新复极差法比较数据之间的差异显著性。采用几率值分析法求毒力回归方程,并求致死中质量浓度及其95%置信限。

2 结果与分析

2.1 灰绿黄堇不同极性溶剂粗提物的触杀作用 灰绿黄堇甲醇、乙醇、丙酮、石油醚和乙酸乙酯5种不同极性溶剂粗提物5倍稀释液对粘虫3龄幼虫均具一定的触杀作用,其中以甲醇粗提物触杀作用最强,其校正死亡率为15.5%,由此确定甲醇为最佳提取溶剂(表1)。

2.2 灰绿黄堇甲醇粗提物不同溶剂萃取物的触杀作用 灰绿黄堇甲醇粗提物用石油醚、乙酸乙酯和氯仿3种不同极性溶剂萃取,以氯仿萃取物粘虫3龄幼虫的触杀作用最强,其校正死亡率为87.50%;其次为石油醚和乙酸乙酯萃取物,校正死亡率分别为30.00%和23.33%,由此确定氯仿为最佳萃取溶剂(表2)。

表3可知,氯仿萃取物随着稀释倍数的提高,对粘虫的校正死亡率逐渐降低,其毒力回归方程为 y=-5.098 7+4.567 5x(相关系数为0.985 2),致死中质量浓度 (95%置信限)为13.071 3(12.364 2～13.818 9)g/L。

2.3 氯仿萃取物对生长发育的抑制作用灰绿黄堇甲醇粗提物氯仿萃取物对粘虫3龄幼虫具有很强的生长发育抑制作用,处理后3和5 d的生长发育抑制率分别为88.66%和60.28%;处理后7 d仍有一定的生长发育抑制作用,抑制率可达23.12%(表4)。

表1 灰绿黄堇不同极性溶剂粗提物对粘虫3龄幼虫触杀作用的测定结果

2.4 氯仿萃取物的胃毒作用 灰绿黄堇甲醇粗提物氯仿萃取物原液对粘虫3龄幼虫具有很强的胃毒作用,其校正死亡率可达91.38%(表5)。

表2 灰绿黄堇甲醇粗提物不同极性溶剂萃取物对粘虫3龄幼虫触杀作用的测定结果

表4 灰绿黄堇甲醇粗提物氯仿萃取物对粘虫3龄幼虫生长发育抑制作用的测定结果

表5 灰绿黄堇甲醇粗提物氯仿萃取物原液对粘虫3龄幼虫胃毒作用的测定结果

3 讨论与结论

灰绿黄堇为我国特有,分布较广,生物量较大,杀虫活性高,具有良好的开发利用前景。本研究结果表明,灰绿黄堇不同极性溶剂粗提物对粘虫3龄幼虫的触杀作用以甲醇粗提物最强,在22.08 g/L质量浓度下的校正死亡率为15.5%;甲醇粗提物不同极性溶剂萃取物的触杀作用则以氯仿萃取物最强,在质量浓度22.08 g/L下的校正死亡率可达 87.5%,其毒力回归方程为y=-5.098 7+4.567 5x,致死中质量浓度为13.07 g/L;氯仿萃取物对粘虫3龄幼虫具有很强的生长发育抑制作用和胃毒作用,生长发育抑制率和校正死亡率分别为88.66%和91.38%。今后将继续研究氯仿萃取物对蚜虫、红蜘蛛、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾和棉铃虫等害虫的杀虫活性和作用方式。

近年来应用化学农药产生的“3R”问题给人类健康带来了严重隐患,并且造成生态环境失衡,引发有害生物产生抗药性和害虫再猖獗,导致害虫天敌及其他有益生物数量下降、人畜中毒。为了改善人类的生存环境和食物品质,世界众多科学家们已把寻找高效、低毒、低残留和与环境和谐的生态合理农药作为农药的研发方向,从植物中提取分离杀虫活性成分的研究受到了广泛的关注[13-14]。

灰绿黄堇的开发利用可考虑两条途径,一是制成粗制品或粗提取液直接用于防治害虫;二是对氯仿萃取物开展分离提纯,鉴定出杀虫活性成分的化学结构,确定主成分;探明各成分之间有无协同、增效、拮抗作用;明确主成分的杀虫作用机理、杀虫谱和作用方式[15-16];对主成分开展仿生合成和结构优化、人工合成,为利用灰绿黄堇创制高效、低毒、低残留新型农药提供理论依据。

[1]王继生,张莉,邱宗荫,等.灰绿黄堇镇痛抗炎作用的实验研究[J].中药药理与临床,2005,21(5):33-34.

[2]王继生,张莉,邱宗荫,等.灰绿黄堇总生物碱镇痛抗炎作用的实验研究[J].中国药房,2007,19(7):468-470.

[3]马国中.灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎的作用研究[J].中国实用医药,2008,29(3):8-10.

[4]唐艳丽,杨爱梅,汪汉卿,等.灰绿黄堇生物碱化学成分的研究(I)[J].中国中药杂志,2005,30(3):195.

[5]赵东保,唐艳丽,汪汉卿,等.灰绿黄堇生物碱化学成分的研究(Ⅱ)[J].中国中药杂志,2005,30(22):1756.

[6]梁俊玉,张继,刘阿萍,等.灰绿黄堇生物碱的研究[J].中药材,2007,30(11):1386-1387.

[7]龙晓燕.灰绿黄堇总生物碱的抗炎镇痛作用及毒性观察[J].时珍国医国药,2007,18(3):599-600.

[8]曹春林.中药药剂学[M].上海:科学技术出版社,1988:60-72.

[9]周静,胡冠芳,刘敏艳,等.4种曼陀罗对粘虫和菜青虫的触杀和拒食作用研究[J].甘肃农业大学学报,2008,6(3):102-106.

[10]NY/T 1154.6—2006.中华人民共和国农业行业标准[S].

[11]袁林,薛明,刑建,等.黄荆提取物对几种害虫的杀虫活性[J].农药,2004,43(2):70-72.

[12]张国洲,王亚维,徐汉虹,等.瑞香狼毒提取物对昆虫的生物活性研究[J].湖南农业大学学报,2004,26(3):190-192.

[13]曾鑫年.植物杀虫剂和拒食剂:新来源及展望[J].农药译丛,1995,17(3):21-24.

[14]白玲.2009年我国农药需求总量将增长5%[J].草业科学,2008,25(11):94.

[15]姚健,赵保堂,王俊龙,等.甘肃黄花蒿超临界CO2萃取产物化学成分的差异性分析[J].草业科学,2009,26(3):57-63.

[16]张新虎,何静,沈慧敏,等.苍耳提取物对番茄灰霉病菌的抑制用及抑菌机理初探[J].草业学报,2008,17(3):99-104.