丙型肝炎免疫层析诊断试剂研制和性能分析

蒋树海 杨发青 Tony Lee 王朝南 孙树叶 田 辉 王之婴

全球约1.7亿人感染丙型肝炎病毒（HCV），危害十分严重[1]。我国HCV的感染率约为3.2%，HCV抗体携带者达4千万[2]。我国将HCV抗体检查列为我国法定的血源性筛查项目。当前最为常用的HCV抗体检测方法是ELISA法，将C22-3、C33C、C100-3和NS5作为包被抗原，标记抗人IgG进行检测[3]。免疫胶体金技术是新型的免疫学检测方法，具有检测简便、稳定性好、适于现场检测等特点，但运用免疫层析技术对HCV抗体检测具有一定的技术难度。本文报道一种以双抗原夹心胶体金法研制HCV抗体诊断试剂盒的方法，及其对临床性能分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 HCV抗原：为HCV NS3、Core融合抗原，来自美国和军事医学科学院，用于试剂的包被和标记；氯金酸BSA，PEG20000，水解酪蛋白：Sigma试剂：Sigma试剂，NC膜：Millipore公司。其他常用试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 干扰样本

包括高血脂、溶血、黄疸血清，含抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆，含相关传染病抗体阳性血清，由本公司在相关医院收集、验证并保存，HCV抗体阴性。1.1.2 HCV抗体国家血清盘中国药品生物制品检定所研制。

1.1.4 HCV抗体ELISA试剂盒

1.1.5 临床样本 共581例，由中国药品生物制品检定所收集，为献血员和HCV患者样本。

1.2 方法

1.2.2 HCV重组抗原的包被

用0.01mol/L pH7.2 PBS将HCV重组抗原稀释成适当适当浓度，喷膜包被，包被完成后将NC膜在干燥间干燥6～8h，备用。

1.2.1 HCV重组抗原的胶体金标记

以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用K2CO3将溶液调到pH 8.0。按每1mL溶液加入10μg重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌1h，再以BSA和PEG20000进行封闭，离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至胶体金稀释液中。然后将标记胶体金溶液涂抹在无纺布载体上，制成胶体金垫。按同样方法标记鼠IgG，制备的鼠IgG胶体金垫用于试剂质控。

1.2.3 试纸组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、PVC板、上样垫、在PVC板帖包被好的NC膜，NC膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴上样垫，NC膜上缘粘贴吸水滤纸，再切成4mm宽的试纸条。密封于铝箔袋中，组装成成品。

1.2.4 性能分析评估

建筑劳务企业作为推动我国经济发展的重要支柱之一，理所当然应当受到国家的高度重视。为了推动建筑劳务企业的发展，国家应当紧跟时代步伐，不断完善建筑相关的法律法规，从而规范建筑劳务企业可能出现的种种不良行为，并为他们提供相应的发展方向。建筑劳务企业也应当在满足法律法规的前提下，制定符合自身发展需要的内部规章制度，从而为自身的发展提供制度保障。建筑劳务企业可以建立内部激励机制、质量保障机制以及实名制管理等，这些制度的建立都能够有效提高工作效率以及工作质量，实现自身的可持续发展。

将公司保存的含不同抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆，高血脂、溶血、黄疸血清；关传染病HAV、HIV、HBV、HP和TP抗体阳性血清取出，用试剂进行检测。

1.2.5 稳定性分析

①将快速诊断试剂置于37℃、50℃条件下，每隔7d取出部试剂，进行测试。②将快速诊断试剂在室温条件下保存。③在实际保存状态下每天至6个月取出试剂，进行测试。

1.2.6 国家参考品血清盘的检测

取出HCV抗体国家参考品，平衡到室温后，将快速诊断试剂条平放，在上样垫上滴加50～100μL被检测样品，在30min根据检测线是否出现判定结果。

1.2.7 临床样本分析

581份临床样本同时用Ortho、Murex和Sorin 3种ELISA试剂和快速诊断试剂进行检测，计算并统计本试剂的临床性能。

2 结 果

2.1 分析特性能

检测结果试剂对高血脂、溶血、黄疸血清检测均为阴性；HAV、HBV、HIV、TP和HP抗体阳性样本；不同抗凝剂测均为阴性，对以上物质没有非特异性反应。

2.2 稳定性分析

在室温条件下，6、9、12、18个月检测均能通过HCV国家血清盘测试。37℃条件共检测到6周，50℃条件下共检测到3周，均能通过HCV国家血清盘测试。根据加速破坏试验结果，快速诊断试剂的稳定性较好，室温条件下稳定性达到18个月。

2.3 国家血清盘检测

以国家参考品作为样品进行测试，检测结果和规定标准完全一致，并且敏感度样本全部检出，见表1。

2.4 对临床样本分析

表1 快速诊断试剂对HCV抗体国家血清盘测试

对581份临床样本进行检测，均检测出样本中有300份以上的HCV抗体阳性样本，但并不完全一致，见表2。

表2 4种试剂对临床样本HCV抗体的检测结果

3种试剂间共有61份样本存在部分检测结果不一致现象，相互间的符合率为91%至96%。

由于单个试剂可能存在一定的假阳性和假阴性，以3种ELISA试剂中的2种检测一致结果作为标准分析更能反应样本的真实情况，对比分析，统计结果如下，见表3。

表3 2种ELISA试剂一致检测结果和本试剂对比分析结果

3 讨 论

HCV抗体检测一直存在难度，需要检测抗多种抗体联合包被以提高检测的敏感度[4]。多种诊断用抗原增加了试剂研制的复杂性，对于HCV抗体快速诊断试剂成功的研究报道有限。HCV抗体诊断ELISA试剂由于的Core抗原的特殊性，虽然已发展到第3代，但一直采用间接法进行检测。由于蛋白和胶体金的标记为物理吸附[5]，所以抗原可能和胶体金标记并保持其活性，实现双抗原夹心法快速检测。双抗原夹心法存在两次特异性抗原－抗体的结合，同时双抗原夹心法能检测出样本中IgM，亦能增加检测的敏感度，特别对于HCV，IgM经常出现[6]。

本研究采用了双抗原夹心法对HCV抗体进行检测。研究过程中经不断试验和优休。对国内外数个不同来源抗原进行筛选，最后得到了理想的抗原和工艺技术，研制出理想的试剂，性能稳定性良好。临床样本分析表明，和高质量ELISA相比，阴性符合率为97.4%，阳性符合率为96.5%，说明研制的快速诊断试剂和ELISA无显著性差异，性能相似。由于免疫快速诊断试剂具有稳定性好检测方便、快速等特点，高性能的HCV抗体免疫快速检测试剂和ELISA试剂互补，能在临床上特别是中小医院得到广泛运用，辅助诊断丙型肝炎，具有重要的社会意义。

[1] Baldo V,Baldovin T,Trivello R,et al.Epidemiology of HCV infection[J].Curr Pharm Des,2008,14(17)：1646-1654.

[2] 彭劼.慢性丙型肝炎的研究进展[J].医学研究杂志,2008,37(3)：5-7.

[3] Roggendorf M,Lu M,Meisel H,et al.Rational use of diagnostic tools in hepatitis C [J].Hepatol.1996,24(2 Suppl)：26-34.

[4] Chen M,Sallberg M,Sonnerborg A,et al.Limited humoral immunity in hepatitis C virus infection [J].Gastroenterology,1999,116(1)：135-143.

[5] Nikki R.Immunogold conjugation for IVD applications[J].IVDT,2002,8(3)：33-36.

[6] Nikolaeva LI,Blokhina NP,Tsurikova NN,et al.Virus-specific antibody titers in different phases of hepatitis C virus infection [J]. J Viral Hepat,2002,9(6)：429-437.