基因工程技术在牡丹研究中的应用现状与展望

霍瑾茹

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

牡丹（Paeonia suffruticosa），又名富贵花、百两金、木芍药、鼠姑、鹿韭，为芍药科芍药属多年生灌木植物，是一种原产于中国西部秦岭和大巴山一带山区的传统名花，享有“花王”的美誉。我国既是牡丹野生种的原产中心和分布中心，又是牡丹园艺品种的栽培中心，拥有四大品种群系。随着分子生物学的迅猛发展，基因工程技术在牡丹上也得到了较为广泛的应用。

1 分子标记技术在牡丹亲缘鉴定上的应用

我国具有极为丰富的牡丹资源，据初步统计，全国仅栽培的牡丹品种就达800个以上。由于牡丹异花授粉的特性，种间极易杂交，以及长期引种、选择的结果，已很难单从植物的外部形态上来确定品种的来源、名称和品种间的亲缘关系，常出现同名异种或同种异名的问题，这些都给准确进行牡丹品种资源的筛选、鉴定和利用带来了困难。关于牡丹品种鉴定，过去几十年里，研究者在形态学、孢粉学、细胞学等方面做了大量工作。近些年来，许多学者在DNA水平上深入研究牡丹种间、种与品种间及品种群间的相互关系，揭示出形态学无法分析解决的方面。利用DNA分子标记技术，迅速建立起我国牡丹品种的标准指纹图谱数据库，对种质资源的快速鉴别、种质资源知识产权保护、园艺植物国际登录、分子标记育种和优异种质创新等方面将发挥重要作用。

1.1 RAPD技术

利用RAPD技术，陈向明等对35个不同花色牡丹品种亲缘关系进行分析，认为来源相同、花色相同的品种间亲缘关系相对较近，但多数遗传组的划分与花色系列间并未有一致的关系；Hosoki等对19个牡丹品种亲缘关系进行分析，得出遗传聚类组的划分与花色并不完全一致。孟丽等对11个牡丹野生类群和12个栽培品种亲缘关系进行分析，认为与栽培牡丹间亲缘关系从近到远依次为杨山牡丹、四川牡丹、卵叶牡丹、紫斑牡丹和矮牡丹，RAPD试验扩增出的25个特异标记可用于牡丹组内种间、品种间的分类与鉴定。邹喻苹等利用RAPD标记分析了牡丹组种内与种间遗传关系，结果与洪德元根据形态性状对该组所做的分类处理基本相符。

1.2 AFLP技术

AFLP（扩增片段长度多态性）作为一种分子标记因其具有带型丰富、用样量少、灵敏度高、快速高效等特点，已被用于检测遗传多样性、构建遗传图谱和定位克隆基因、天然居群的遗传结构与保护生物学研究等方面，成为材料间遗传多样性和分类研究的有效手段。袁涛对牡丹7个野生种和32个品种的遗传多样性和亲缘关系AFLP分析结果显示，野生种的遗传多样性明显高于品种的遗传多样性。但是，四川牡丹没有参与中国栽培牡丹品种群的起源与演化，完全与孟丽的结论不一致。因此，四川牡丹在栽培牡丹品种群的起源与演化中的地位尚不清楚.侯小改发现与革质花盘亚组与栽培牡丹亲缘关系从近到远的4个种依次为：杨山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵叶牡丹，且矮牡丹和卵叶牡丹有较近的亲缘关系，但缺乏四川牡丹。侯小改将30个牡丹品种完全区分开，多数选育地相同的牡丹种质表现出较为密切的亲缘关系。当其他性状相差不大时，株高相近的品种间亲缘关系相对较近。李保印等利用AFLP技术对中原牡丹品种建立了由60个样本组成的核心种质。

1.3 SRAP技术

相关序列扩增多态性（SRAP）是一种新型的基于PCR的标记方法，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros提出。该标记通过独特的引物设计对可读框（open reading frames，ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记将AFLP和RAPD两者的优点有机的结合起来，具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点。SRAP标记是对基因的重要组成部分ORFs进行扩增，基因的多样性更能反映遗传资源的多样性，SRAP标记在这方面的应用较为广泛。

HAO等对29个品种的牡丹进行研究表明，SRAP标记是非常有效的识别牡丹品种和杂交种的标记方法。其鉴定结果与形态观察的结果一致，且操作简便，可大大降低引物合成费用，提高引物的使用效率。郭大龙等对影响牡丹SRAP反应的各因子进行正交试验，得到牡丹最佳的反应体系和反应程序，为SRAP技术在牡丹育种上的应用奠定了基础。

2 基因工程技术在控制牡丹种质创新上的应用

牡丹的花期较短，且花期较集中，给牡丹花会的举办和人们赏花带来不便，如何延长牡丹花期成为迫切需要解决的问题。牡丹花属乙烯敏感型，乙烯的大量产生是牡丹花衰老的主要原因。在高等植物体内乙烯的生物合成是由前体物质SAM（S一腺苷甲硫氨酸）在ACS（ACC合成酶）和ACO（ACC氧化酶）的催化下形成的，ACS和ACO是乙烯生物合成过程中的2个关键酶。通过ACC氧化酶的反义基因技术，可望有效抑制乙烯生成，从而延长牡丹花期。杨英军等通过PCR扩增，已获得长度约500 bp的片段，经测序发现该片段与已知序列同源性为98.2%，表明牡丹ACC氧化酶基因部分序列克隆成功。进一步将克隆到的牡丹ACC氧化酶片段与植物表达载体pBI 121反向连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，成功构建了牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体，为进一步通过反义技术获得抗衰牡丹资源奠定了基础。

3 展 望

基因工程技术在牡丹研究中的应用已取得了较大进展，但广度和深度还有待扩大。国内牡丹分子水平的研究主要集中在品种间亲缘关系的研究，在农作物育种及转基因花卉方面的研究及应用尚处在起步阶段。

传统的育种手段已远远满足不了人们对于牡丹色、香、花期等的新品种需求。由于牡丹组织再生及组培苗驯化存在诸多困难，目前尚无法运用农杆菌介导和基因枪转化法进行牡丹转基因技术研究。

自1987年Meyer获得转基因矮牵牛以来，花卉基因工程迅速发展，并已成为花卉育种的新趋势.花卉基因工程通过抑制内源基因或导人外源基因而定向改造特定性状且不丧失原有性状，大大缩短了新品种选育的时间；而且可以突破种间不亲和的限制，将目的基因引入原来没有这种基因的物种，从而极大地改良花卉品质，甚至创造新品种。

近年来发展的花粉管通道法转基因技术避开了再生的障碍且操作简单，已在小麦、大豆等作物上获得成功。花粉管通道法转基因技术的不断成熟为牡丹性状的分子改良提供了一条全新的思路。花粉管通道法转基因技术是现阶段一种潜在的适宜于牡丹的转基因方法。花粉管通道在花柱中的形成是进行花粉管通道法转基因的前提。花粉管在花柱中的生长速度因植物种类的不同而差异很大，明确牡丹花粉管形成所需时间，对于牡丹花粉管通道法转基因技术研究是十分必要的。

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