木瓜蛋白酶体外酶解苜蓿草粉适宜条件的研究

周 群，玉永雄，刘景环，康红军

（西南大学重庆牧草与草食家畜重点实验室，重庆 北碚 400716）

有研究表明，苜蓿含有动物所需要的各种必需氨基酸，而且含量丰富、品质好，限制性氨基酸特别是赖氨酸含量丰富。苜蓿氨基酸组成比例较为均衡，且苜蓿价格较低，用其部分替代豆粕可以降低饲料成本，提高养殖户的经济效益，这是一种解决植物性蛋白质缺乏的有效途径。由于不同蛋白质的氨基酸组成与空间结构不同，在动物体内的消化吸收率也大不相同。当蛋白质被水解为小肽和游离氨基酸后，其吸收利用率就会大大增加。因此，为了充分利用好蛋白质资源，对蛋白质进行水解是十分必要的。以蛋白质为原料，水解制取氨基酸的方法有酸水解法、碱水解法和酶水解法3种。酸水解法水解虽彻底，但条件剧烈，色氨酸全被破坏，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸被部分破坏；水解液需经过中和及脱盐处理，工艺路线长，能耗高，设备腐蚀大，营养成分损失多。碱水解只能得到消旋化的氨基酸，羟基氨基酸、巯基氨基酸全被破坏；且造价高，设备腐蚀严重，营养成分损失也大。酶水解法反应条件温和，操作简单，能保留更多的营养成分，且水解过程易控制，不会造成大的环境污染。本试验的目的就是在酶解法的基础上，结合王文亮、王利民确定的底物用量、木瓜蛋白酶消化温度和时间、最适酶解温度，研究体外酶解部分苜蓿草粉替代豆粕的最适反应条件，包括最适酶浓度、酶解温度、时间等主要参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 苜蓿草粉：刈割西南大学牧草实验室后山试验田种植的紫花苜蓿草，晾晒、烘干后粉碎为80目的苜蓿草粉，粗蛋白含量为20%；豆粕：市售豆粕，粗蛋白含量为45.86%；木瓜蛋白酶：广西某生物制品有限公司生产，酶活力为300万U/g。

仪器：电子天平，自动凯氏定氮仪，水浴锅。

1.2 试验方法

1.2.1 苜蓿草粉及豆粕蛋白质含量测定、混合底物及产物内蛋白质含量测定 采用凯氏定氮法。

1.2.2 酶解反应 利用蛋白替代法得到苜蓿草粉与豆粕混合物，加入一定量的三蒸水制备成酶解底物。加入一定量的酶后，将试验样品放入恒温水浴锅中进行酶解反应，反应一定时间后取出样品立即置沸水浴中加热10min，灭活酶以终止反应。

1.2.3 水解度的测定 将反应后的酶解物进行固液分离，分别测定其蛋白质含量。固态反应产物内蛋白质含量减少量与原样品中蛋白质含量的百分比即为判断酶解效率的指标。百分比低则酶解效率高，蛋白质的水解度高，游离出的氨基酸及小分子肽链多，反之则相反。

2 结果与分析

2.1 酶浓度对水解度的影响 制备18g苜蓿草粉与豆粕的混合物，其中12g豆粕，6g苜蓿草粉。在混合物中加入92g三蒸水配制成酶反应底物。加酶量分别为0.0075g、0.015g、0.02g、0.03g。反应温度为 65℃，反应时间10h。不同加酶量对水解反应的影响如图1所示。

图1 加酶量对水解度的影响

当底物浓度一定时，底物的水解度取决于酶的浓度。理论上讲，酶分子愈多，水解度愈大，但由图1可看出，开始时水解度随酶浓度的增大而增大得较快，当加酶量为0.02g时，水解度达到最大值，酶浓度继续增大水解度变化不大，且有下降的趋势。

2.2 温度对水解度的影响 设定加酶量为0.02g，分别置于19℃、30℃、40℃、50℃、65℃ 5个不同的水浴反应温度进行酶解反应，其他条件不变，结果见图2。

分析图2可知，水解度随反应温度的升高而升高，当反应温度达65℃时，水解度最高。因考虑到生产过程中很难达到高温度酶解的条件，故没有设定更高反应温度水平。结果表明，木瓜蛋白酶在加酶量为0.02g，即底物浓度0.11%时的最适反应温度为65℃。

图2 反应温度对水解度的影响

2.3 水解时间对水解度的影响 在加酶量为0.02 g，温度 65℃条件下，取 3h、5h、8h、10h 4个不同反应时间进行酶解反应，结果见图3。

图3 反应时间对水解度的影响

由图3可看出，水解度随时间的延长而增加，反应时间为10h时，水解度最高。因此，木瓜蛋白酶水解苜蓿蛋白的时间控制在10h左右为宜。

3 结论

温度对酶解液的蛋白质含量具有较大影响，温度为65℃时，蛋白质水解率比较高。酶浓度在试验范围内，蛋白质酶解率随着酶用量的增加而升高。综合其他因素和从经济角度考虑，酶用量为0.02g时最好。因此，木瓜蛋白酶体外酶解苜蓿草粉替代部分豆粕的最佳工艺条件是：酶用量为0.02g，水解温度为65℃，水解时间为10h。

[1]胡跃高.我国饲料资源现状与农业发展[J].西北农业大学学报，1994，（2）：50-55.

[2]彭家江.大力开发利用植物性蛋白质饲料资源[J].江西畜牧兽医，1999，（1）：39.

[3]张玉发.试论苜蓿生产在我国农业三元种植结构调整中的地位和作用[J].草业科学，1999，（2）：10-12.

[4]宋玉翠，孟宪军，陕 方，等.关于蛋白质水解活性肽物质的思考[J].食品工业科技，2005，（11）：185-187.

[5]王文亮，孙爱东.木瓜蛋白酶水解黄粉虫蛋白质工艺条件的优化[J].食品与药品，2007，9（8）：5-7.

[6]王利民，刘 宁，谭爱娟，等.木瓜蛋白酶的生产工艺研究[J].贵州农业科学，2000，（5）：24-25.