高压脉冲电场对苹果汁中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的钝化效果*

李静，肖健夫，陈杰，廖小军

1(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京，100083)2(清华大学电机工程与应用电子技术系，北京，100084)

高压脉冲电场对苹果汁中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的钝化效果*

李静1，肖健夫2，陈杰2，廖小军1

1(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京，100083)2(清华大学电机工程与应用电子技术系，北京，100084)

研究了高压脉冲电场(pulsed electric fields，PEF)对接种于苹果清汁中的大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylocuccus aureus)的钝化效果。研究显示，随着电场强度、处理时间和样品电导率的增大，PEF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果增加，其中金黄色葡萄球菌对PEF更敏感。电场强度和处理时间均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的残活率对数值lgS有极显著影响(P＜0.01)。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的临界电场强度EC分别为15.9 kV/cm和16.4 kV/cm。双极性脉冲比单极性脉冲对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果好(P＜0.01)。输入能量密度越高，PEF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果越好。

高压脉冲电场，苹果汁，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌

热杀菌技术是食品加工保藏的重要手段，但它会破坏食品的色、香、味、功能性及营养成分，随着广大消费者对食品营养、感官品质的要求越来越高，非热加工技术的应用将成为一种发展趋势［1］。高压脉冲电场(PEF)作为一项新兴的非热加工技术，具有能耗低，温升小，对环境无污染，能最大程度地减少对食品品质的破坏，受到科研人员关注［2］。PEF杀菌效果会受到处理因素(电场强度、处理时间、脉宽、频率、脉冲波形、单双极性、处理温度等)、产品因素(食品成分、电导率、pH值、水分活度等)和微生物因素(微生物种类、浓度、生长期等)的影响［3-4］。

目前，国内外就PEF对苹果汁的杀菌已有一些研究。钟葵等发现，电场强度为25 kV/cm、脉冲数为1 035个，PEF处理可以降低苹果汁中微生物的数量，但降低不到2个对数［5］。Evrendilek等研究了脉冲极性和处理时间对接种于苹果汁中E.coli O157:H7的钝化效果，发现单双极性之间不存在显著性差异，当处理时间在3～1 430 μs时，20 μs的钝化效果最佳［6］。Ribeiro等研究电场强度和处理时间对接种于苹果汁中金黄色葡萄球菌的钝化效果时发现，电场强度和处理时间的延长会增加钝化效果［7］。

为了更系统地研究PEF对苹果汁中微生物的杀菌效果，试验研究了电场强度、处理时间、单双极性、电导率对接种于苹果清汁中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响，并探讨了输入能量密度与PEF钝化效果的关系，为PEF实验或工业生产中杀菌效果的预测和评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 苹果汁制备

苹果汁为市购100%苹果汁，试验前用1 mol/L NaOH溶液于室温下调果汁的pH值为3.7，1 mol/L NaCl溶液于 25℃ 调果汁电导率为 1.0、1.5 或 2.0 mS/cm，之后果汁于121℃灭菌20 min，冷却后接种目标微生物。

1.2 菌种与培养基

大肠杆菌(CGMCC1.90)、金黄色葡萄球菌(CGMCC1.1861)，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。试验所用固体培养基为营养琼脂(北京奥博星生物技术责任有限公司)，液体培养基为营养肉汤。营养肉汤:蛋白胨，10.0 g;牛肉膏，3.0 g;NaCl，5.0 g;蒸馏水，1 000 mL，pH 值 7.0，121℃ 下灭菌20 min，冷却后于4℃放置待用。

1.3 微生物培养与测定

用接种环从斜面挑取适量目标微生物接入营养肉汤，分别在37℃下培养12 h(大肠杆菌)、18 h(金黄色葡萄球菌)，使其达到稳定生长早期。将培养好的菌液于4℃下，5 500 r/min离心10 min，弃去上清液，菌体复溶于无菌水中离心洗涤2次后，溶于与营养肉汤等量的无菌苹果汁中，使微生物的数量达到10～10CFU/mL。将PEF处理前后的苹果汁倒平板，放置37℃下培养24 h后计数。杀菌效果采用残活率对数值lgS表示:

式中:N为PEF处理后的微生物数量，CFU/mL;N0为PEF处理前的微生物数量，CFU/mL。

1.4 PEF杀菌系统

试验所用的高压脉冲电场杀菌设备(图1)为中国农业大学与清华大学自主研发设计，主要由高压脉冲发生装置、数据采集控制系统、处理室和无菌操作系统4部分组成。处理室出口的精密热电阻温度计可迅速测得样品温度。PEF主要试验参数见表1。

物料杀菌处理流动方向:进料口→齿轮泵→处理室→出料口。每次试验前，用50 mg/L ClO2消毒液清洗管道15 min，再以无菌去离子水清洗20 min，同时无菌柜里紫外杀菌20min以保证无菌环境。PEF处理过程中样品放置在冰水浴里，以最大程度保证微生物处于稳定生长早期。样品连续通过PEF处理室，待PEF设备稳定工作13 min后，开始取样，1 min取1次，连续取3次。处理后样品温度低于60℃。

图1 PEF试验装置图

表1 PEF主要试验参数

1.5 试验方案设计

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为研究对象，接种于苹果汁，电导率为 1.0、1.5、2.0 mS/cm，电场强度为 25、30、35、40 kV/cm，时间为 37、56、74 μs，波形为单、双极性。

1.6 数据处理

1.6.1 PEF电场强度E和处理时间t的计算

式中:U，实际电压，kV;d，电极板间距，0.4 cm;n，处理室个数;V，处理腔体积，0.05mL;f，频率，Hz;W，脉宽，μs;ν，流速，mL/s。

1.6.2 方波输入能量密度计算

式中:W，方波输入能量密度，J/cm3;t，处理时间，s;U，脉冲电压，V;R，等效电阻，Ω;σ，溶液电导率，S/cm;s，处理腔面积，m2;l，处理腔间距，m;r，处理腔半径，m。

1.6.3 数据统计分析

所有试验至少重复2次。所得数据采用Oringin-Pro 7.5统计分析并制图。

2 结果与分析

2.1 电场强度和处理时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

当样品电导率为1.0 mS/cm，波形为单极性脉冲方波时，电场强度和处理时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果如图2。随着电场强度或处理时间增大，PEF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果增强，这与 Hülsheger［8］、Pothakamury［9］和 Damar［10］等人的研究结果一致。

经过分析，得到电场强度和处理时间对2种目标微生物的钝化都有极显著影响(P＜0.01)。本研究中，在电场强度40 kV/cm、处理时间74 μs时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别降低3.84和5.27个对数。

对不同电场强度下的钝化效果进行线性拟合(图2)，可得到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的临界电场强度 EC分别为15.9 kV/cm 和16.4 kV/cm。Damar报道大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的EC分别为11.21～12.19 kV/cm 和 11.30 ～ 11.72 kV/cm［10］;Grahl 计算大肠杆菌的EC为11.9 ～14.2 kV/cm［11］。这种微小差异可能与处理条件和微生物菌株不同有关。

图2 电场强度和处理时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

2.2 电导率和电场强度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

电导率是影响PEF杀菌效果最重要的因素之一，它决定处理室的电阻，从而可能影响电场强度、脉宽、物料的温升［12］。处理时间74 μs的单极性脉冲波形条件下，电导率和电场强度对2种目标微生物的钝化效果见图3，PEF的钝化效果随电导率和电场强度的增大呈增强趋势。但是，Alvarz［13］和 Wouters［14］等认为，电导率增大会使电场强度减小从而降低PEF对微生物的钝化效果。在外界离子浓度对微生物渗透压影响可忽略的情况下，杀菌效果与电导率的关系由PEF系统参数、电导率值及其变化范围决定。本试验样品电导率为 1.0～2.0 mS/cm，而 Alvarez和Wouters等人的样品电导率分别为2～4 mS/cm和2.7～7.9 mS/cm。电导率及其变化较小，其对电场参数的影响也小，根据方波输入能量密度公式(见1.6.2)，电导率越大，输入能量密度越大，PEF钝化效果越好。反之，电导率及其变化较大时，电导率的增加会导致方波波形发生严重畸变，方波上升时间加大，相对于脉宽的影响不可忽略，故而使有效处理时间减小，从而降低PEF钝化效果。

图3 电导率和电场强度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

2.3 单、双极性脉冲对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

当样品电导率为1.0 mS/cm、处理时间为74 μs、电场强度为25、30和35 kV/cm时，单、双极性脉冲对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果见图4。同一电场强度下，2种目标微生物对双极性脉冲更为敏感，因为双极性脉冲较单极性脉冲对微生物细胞膜提供了一个额外的压力［12］，并且由于电场方向的迅速反转，使得细胞膜中带电基团的方向发生改变［6］。另外，双极性脉冲还具有耗能小，可有效降低液体电解和固体在电极表面沉降等优点［15］。

图4 单、双极性脉冲对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

2.4 输入能量密度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

输入能量密度也是影响PEF对微生物钝化效果的重要因素，它反映了电场强度、处理时间和电导率的综合作用。如图5所示，2种目标微生物的残活率随输入能量密度增大而降低，且输入能量密度对2种目标微生物钝化效果的拟合曲线分别为:y=8.742× e(-x/15.128)-7.985(R2=0.910) 和 y=12.211 ×e(-x/27.026)-12.659(R2=0.913)。

同样的输入能量密度下，PEF对金黄色葡萄球菌的钝化效果较对大肠杆菌的钝化效果强，这个结论与Damar［10］和 Ayman［16］的不同。原因可能是:一、同种菌的不同菌株对PEF的敏感度不同［17］;二、大肠杆菌虽然细胞壁薄，但是细胞壁成分复杂，尤其是其中含有的脂多糖，蛋白质等成分，会对细胞有一定保护作用［18］。

图5 输入能量密度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌钝化效果的影响

3 结论

随着电场强度、处理时间的增大，PEF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果增加，金黄色葡萄球菌对PEF更敏感。电场强度和处理时间均对2种目标微生物的残活率有极显著影响(P＜0.01)。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的临界电场强度EC分别为15.9 kV/cm和16.4 kV/cm。当样品电导率及其变化范围较小时，PEF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的钝化效果随电导率的增大而增加。双极性脉冲比单极性脉冲对2种目标微生物的钝化效果好(P＜0.01)。输入能量密度越高，PEF对两种目标微生物的钝化效果越好。无冷却处理条件下，PEF可使物料温度升高2.2～30.6℃，对果汁的品质影响需做进一步研究。

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Inactivation of Escherichia coli and Staphylocuccus aureus in Apple Juice by Pulsed Electric Fields

Li Jing1，Xiao Jian-fu2，Chen Jie2，Liao Xiao-jun1
1(College of Food Science ＆ Natritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)2(Department of Electrical Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

The inactivation effect of pulsed electric fields(PEF)on E.coli and S.aureus inoculated into apple juice was investigated.As increasing the electric field strength，total treatment time and electrical conductivity，the inactivation effect of E.coli and S.aureus increased.S.aureus is more sensitive to PEF than E.coli.Both the electric field strength and the total treatment time have a significant inactivation effect on E.coli and S.aureus(P ＜0.01).The critical electric field strengths of E.coli and S.aureus are 15.9 kV/cm and 16.4 kV/cm，respectively.Bipolar appears more efficient than monopolar(P ＜ 0.01).The more the energy density input，the better the inactivation effect of PEF on E.coli and S.aureus.

pulsed electric fields，apple juice，Escherichia coli，Staphylocuccus aureus

硕士研究生(廖小军教授为通讯作者)。

*国家863项目—食品非热加工技术与设备(2007AA100405)

2010-04-25，改回日期:2010-06-04