基于LAPS芯片的味觉感受细胞敏感和传导的研究

陈培华 张 威 陈 鹏 周子予 刘清君 王 平

(浙江大学 生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生物医学工程与仪器科学学院 杭州 310027)

引言

迄今为止，人们知道有五种基本的味觉感受:酸、甜、苦、咸和鲜味，以为了动物能够避免食物腐败，获取能量，避免有毒物质，维持体内离子动态平衡以及品尝到美味。初级的味觉感受器为舌上皮中的味觉感受细胞。根据细胞的超微结构特征，哺乳动物的味觉细胞可以分为四类:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和IV型。由于Ⅰ型味觉细胞为支持细胞，而Ⅳ型细胞为前体细胞，在味觉细胞的生命过程中不断分化为其他类型的味觉细胞，这两类细胞不能产生动作电位，且在味觉感受中的作用目前还不清楚，因此Ⅰ型和Ⅳ型细胞不是本工作的研究重点。甜味受体 (T1R2/T1R3)［1］、苦味受体 (T2Rs)［2］和 鲜味受体 (T1R1/T1R3，mGluR4)［3－4］分别表达于不同群的Ⅱ型细胞中。而Ⅲ型细胞中表达了酸味受体，如ASIC 通道［5］和 /或 PKDL［6］通道。它们分别在相应的味质刺激下，Ⅱ型和ⅢI味觉细胞都能发放动作电位。可是研究证明Ⅱ型细胞与输入神经没有经典的突触连接，Ⅲ型细胞是唯一一种与输入神经纤维有突触连接的味觉细胞。于是，综合最新的生物分子学、免疫组化、膜片钳电生理、在体神经记录和动物行为学等研究进展，得到假设的味觉敏感传导模型:IⅠ型细胞在苦甜鲜味味质的刺激下，产生动作电位，并释放ATP到Ⅲ型细胞;Ⅲ型细胞在酸味味质的刺激下，或是接受Ⅱ型细胞释放的ATP的刺激下，产生动作电位，并释放5-HT到输入神经纤维，然后将味觉信息传递到大脑［7］，如图1(a)所示。

对味觉细胞在味质刺激下的电生理记录有膜片钳全细胞记录 (whole-cell)、细胞贴附式记录(cell-attached)以及非紧密封接的细胞贴附式膜片钳记录 (loose-patch)［8］。由于传统的膜片钳记录操作复杂且对细胞有损伤，不利于对细胞放电模式的长时间记录，于是衍生出非紧密封接的膜片钳记录方式。同时，由于胞内电位以及跨膜电流也能通过胞外电位反映。于是采用 LAPS芯片，对味觉细胞的胞外电位进行记录。这是一种无损的、长期的记录方式，能对味觉细胞在味觉刺激下的时域放电模式做较长时间记录。本研究加工制作的LAP芯片以及LAPS测试系统如图1(b，c)所示。

目前对味觉细胞在味质刺激下释放的神经递质5-HT的记录是采用生物传感细胞 (biosensor cell)［9］。即是采用细胞系HEK293或CHO细胞，将5-HT受体以及下游分子转入该细胞中，并载入Ca2+敏感染料。在味质刺激下，胞内 Ca2+浓度升高，采用荧光显微镜，记录响应的 Ca2+信号变化，从而反映有5-HT的释放。可是该方法的缺点是需要将生物传感细胞培养在离味觉细胞很近的位置，才能使得释放的5-HT被传感细胞捕捉到。利用LAPS芯片可寻址的优点，可将激光光点照射到芯片上任意一点做记录。在LAPS芯片上附着一层约200 μm厚的对5-HT敏感的PVC膜，从而对味觉细胞组织释放的5-HT进行检测。

本研究中，用LAPS对单个味觉细胞在味质刺激下的胞外电位做记录，并利用主成分分析法分析不同类型的味觉细胞的时域响应;并在LAPS芯片上沉积5-HT敏感的PVC膜，对味质刺激下，味觉细胞释放神经递质5-HT进行记录，测试在酸味或是苦甜鲜味味质刺激下是否有5-HT释放。实验发现LAPS芯片为味觉细胞味觉敏感和传导的研究提供了一种潜在的新方法。

图1 味觉传导模型，LAPS芯片及其测试系统。(a)味觉细胞信号传导模式;(b)加工的 LAPS芯片;(c)LAPS测试系统Fig.1 The transduction model of taste sensation，LAPS chip and its measurement system.(a)taste signal transduction model;(b)the fabricated LAPS chip;(c)LAPS measurement system

1 实验方法

1.1 LAPS芯片及其检测系统

采用电解液-绝缘层-半导体(EIS)结构的LAPS芯片。选择电阻率为10～15 Ω·cm的N型硅片。在1000℃ 热生长一层30 nm的SiO2，然后利用等离子增强化学气相沉积(PECVD)一层厚为60 nm的Si3O4。在基底背面再溅射一层1 μm的铝作为欧姆接触。铂丝作为参考电极。LAPS检测系统如图1(c)所示，利用波长为543.5 nm，调制频率为4 kHz(由锁相放大器控制)的激光照射在 LAPS表面，其光点直径约为10 μm。扫描I-V曲线，取斜率最大的点作为记录胞外电位时的工作电压。味觉细胞在味质刺激下的胞外信号耦合在工作电压上，并最终被LAPS记录到，产生与胞外电位成比例的光生电流。通过恒电位/电流仪(EG＆G Princeton Applied Research，Model 273A)自带的电极电路检测出LAPS光生电流并转换成电压，经过前置放大器及模拟滤波器进行信号的放大和预处理，由16位PCI6035数据采集卡和LabVIEW软件控制数据的采集、分析和存储。

1.2 味觉细胞培养和舌上皮制备

选择SD大鼠舌上皮的轮廓状乳头部分，取轮廓状乳头并置于半胱氨酸 (1 mg/mL)激活的木瓜蛋白酶缓冲液中(14 U/mL，无二价离子)，浸泡约为3 h(环境37℃，5%CO2，95% 空气)。取舌上皮，这样得到结构松散的舌上皮，如果细胞有神经递质释放，便容易流出且被LAPS芯片检测到。

在对单个味觉细胞的胞外电位检测时，我们将上面步骤得到的味觉组织置于胞外液中，抖动味觉组织，味觉细胞便从舌上皮中脱离，并培养在用Cell-TAK处理过的LAPS芯片上。在测试前，味觉细胞培养在 DMEM中 2 h(环境37℃，5%CO2，95%空气)。

1.3 5-HT敏感膜制备

笔者在LAPS表面沉积一层对5-HT敏感的PVC膜，其成分包括离子交换剂 KTPClPB(0.5 mg)、溶剂调节剂 Tris(2-ehylhexyl)phosphate(60 mg)、PVC(30 mg)，溶于 1 mL 四氢呋喃中［10］。取该混合溶剂约7～8 μL滴在 LAPS芯片上，等溶剂在室温下蒸发后，在LAPS芯片上留下一层对5-HT敏感的PVC膜，约为200 μm厚。之后，用1 mM的5－HT溶液对此膜进行过夜活化。

2 实验结果

2.1 胞外电位检测

利用可寻址电位传感器(LAPS)对味觉感受细胞在味质刺激下的电信号和化学信号进行记录。在测量前将味觉细胞先培养2 h，在台式液中，扫描I-V曲线，并将工作点电位设在I-V曲线上斜率最大的点并保持不变。如图2(a)所示为Ⅱ型细胞在苦甜鲜混合刺激下 (MgSO4，蔗糖，谷氨酸)，Ⅲ型细胞在酸味刺激下(HCl)产生的时域放电。在酸味(pH=4)刺激下，味觉细胞的放电频率为(2.9±0.3)Hz(n=14);在混合刺激下，味觉细胞的放电频率为(2.54±0.32)Hz(n=10)(图2(b))。当使用相同的味质(选取酸)，不同浓度刺激下，放电频率则随着浓度的改变如图2(c)所示。在台式液环境中时 (pH=7.5)，味觉细胞有少许自发放电，放电频率为(1.35±0.14)Hz(n=14);pH=4时，放电频率为(2.9±0.3)Hz(n=14);当 pH=2时，放电频率为(3.8±0.65)Hz(n=12)。采用主成份分析法 (PCA)对不同味质刺激下的时域放电响应分析表明来自于不同种类细胞的响应形成了不同的簇，如图2(c)所示。正方形为酸响应，三角形为苦甜鲜响应。

2.2 5-HT检测

用不同浓度的5-HT溶液对该膜的特性进行测试。在不同浓度5-HT的情况下，记录IV曲线，它们会有一定程度的平移，如图3(a)所示。线性拟合得到灵敏度为19.1 mVp5-HT(r=0.997)。LASP芯片上的舌上皮如图3(b)所示。之后，对舌上皮分别施加酸味刺激 (图3(c))和苦甜鲜混合刺激 (图3(d))，发现Ⅳ曲线有不同程度的平移，其平移约为30～100 mV。

3 讨论和结论

LAPS芯片对味觉细胞在不同味质刺激下的电信号进行检测。对味觉细胞在不同味质刺激下得到的放电频率统计，结果得到放电频率相差不大，表明不同味质不能简单的由味觉细胞的放电频率表示和编码。但是，在相同味质不同浓度刺激下，放电频率随着浓度的增大而增大，揭示对味质浓度的编码可能依赖于参数放电频率。对味觉细胞在味质刺激下的时域放电模式进行PCA分析，结果表明:由Ⅱ型和Ⅲ型细胞的时域放电响应能够将不同类型味觉细胞所携带的味觉信息分别出来。

LAPS芯片对味觉细胞在味质刺激下释放的5-HT进行检测，发现在味质刺激前后，I-V曲线有不同程度的右移，大约在30～100 mV。通过 LAPS芯片对5-HT响应特性分析，得到味觉细胞释放的5-HT局部浓度大约为10－10－10－7M量级，与 Huang等人利用Ca2+荧光检测方法得到的结果一致［9］。

图2 味觉细胞在味质刺激下的时域放电。(a)味觉细胞在台式液时、酸刺激下和混合刺激 (苦甜鲜)下的时域放电模式;(b)在酸刺激和混合刺激下的放电频率;(c)随pH降低，放电频率增加;(d)对酸和混合刺激下的时域放电的主元分析PCA，酸和混合刺激分别聚集为两簇，正方形:酸刺激;三角形:混合刺激Fig.2 Firing patterns of taste cells upon taste stimuli in time-domain.(a)Thefiringpatternsundertyrode solution，sour stimuli and mix stimuli(bitter，sweet and umami);(b)The firing rate with sour stimuli and mix stimuli;(c)The firing rate increases with pH decreasing;(d)PCA analysis of firing patterns upon sour and mix stimuli from time-domain.It forms two distinct cluster with sour and mix stimuli.Square:sour stimuli;Triangle:mix stimuli

通过LAPS芯片对味觉细胞在味质刺激下电信号和化学信号的胞外记录，得到味觉细胞在味质刺激下会产生动作电位，味觉细胞在不同味质刺激下的放电频率难以用来分辨味质，但味觉细胞在同种味质刺激下放电频率与味质浓度成正比，不同类型的味觉细胞的响应通过时域放电模式是能分辨的;另一方面在味质刺激下，味觉细胞会释放5-HT，与文献结果一致。神经递质5-HT的释放与味觉信息的传递可能相关。另外，LAPS胞外记录方法为味觉细胞的味觉感受等提供了一种无损的新颖记录方式。

图3 在味质刺激下舌上皮中味觉细胞释放的5-HT记录。(a)在各个5-HT浓度下LAPS芯片的响应;(b)镜下LAPS芯片上的舌上皮;(c)在酸味刺激前后记录的I-V曲线;(d)在苦甜鲜混合刺激前后记录的I-V曲线Fig.3 The detection of released 5-HT from taste epithelium upon taste stimuli.(a)The response of LAPS chip to 5-HT with different concentrations;(b)The taste epithelium under microscope;(c)I-V curves before and after sour stimuli;(d)I-V curves before and after mix stimuli

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