体外hEGF对食管癌EC9706细胞增殖影响的研究

华北煤炭医学院中医学系(唐山063000)

贾永森 司富春* 吕翠田* 王媛媛Δ

近年来食管癌的临床和实验研究大都着眼于分子生物学上、下游技术检测癌细胞本身分子水平含量的变化或者药效对其干预作用,而有关体外干预食管癌细胞增殖机制的研究尚不多见。

表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)是体外最强的促表皮细胞生长因子之一,由 Stanley Cohen在小鼠颌下腺分离纯化(m EGF),随后发现人胃酸分泌抑制因子(Urogastrone,UG)即人表皮生长因子(h EGF)主要在颌下腺合成。实验证明,当有 EGF持续存在时,细胞呈多层性生长,其密度可达对照组的4～6倍[1]。本研究观察了h EGF对高分化食管鳞癌细胞株 EC9706增殖的影响。

材料与方法

1 材 料 人食管癌细胞株 EC9706由中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠;人表皮生长因子(h EGF)(sigma公司);RPMI 1640培养基(GIBCO公司);小牛血清(BCS)(GIBCO公司);胰蛋白酶(华美公司);MTT(Amresco公司);DMSO(Amresco公司);RNase A(sigma公司);碘化丙啶(PI)(sigma公司)

2 方 法

2.1 细胞培养:从液氮中取出冻存的EC9706细胞,37℃水浴使之解冻。吸出细胞悬液,移入离心管中,补加 10ml RPMI 1640培养液,吹打、混匀,1000rpm×10min离心,弃上清,加入含 10%小牛血清的RPMI1640培养液 10ml,吹打混匀后接种于Φ100mm培养皿中,置于培养箱培养。每 2～3天传代1次。

2.2 MTT实验

2.2.1 量效关系:5×104个/0.5ml细胞悬液,接种于24孔平面培养板中,500μl/孔。置 37℃、5%CO2培养箱中,细胞贴壁 24h后,弃上清,以不含血清培养液清洗各孔贴壁细胞中残留血清成分,600μl/孔,重复1次。加入不含血清培养液 500μl/孔,饥饿细胞 24h,弃旧培养液,以不含血清 RPMI1640培养液配制不同浓度 hEGF工作液:400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml 6个梯度,每组 3个复孔,同时对应 2个复孔加入不含血清培养液,做空白平行对照,500μl/孔。继续培养 24h后,吸去上清液,MTT法测定光吸收值(OD值),实验重复 3次。按照公式:

h EGF刺激 EC9706细胞增殖率=(hEGF组 OD值 /对照组 OD值-1)×100%绘制量效关系曲线图,确定hEGF最高刺激增殖浓度。

2.2.2 时效关系:细胞培养同 2.2.1,以不含血清培养液配制h EGF最高刺激细胞增殖浓度,加入24孔板 3～6列共 16个复孔中作为h EGF组,1～2列 8个复孔加入不含血清培养液作为空白对照平行复孔,分别于12h、24h、36h、48h测定第 1、2、3、4行OD值,方法同 2.2.1。实验重复 3次。

绘制时效关系曲线图,观察h EGF刺激细胞增殖与时间的关系。

2.3 镜下观察hEGF对人食管癌 EC9706细胞增殖和形态的影响:以 1×106个细胞 /皿的密度接种EC9706细胞于Φ100mm培养皿中,10ml/皿,于37℃,5%CO2,饱和湿度的CO2培养箱培养 24h,弃旧培养液,加入不含血清培养液 10ml/皿,饥饿细胞 24h,加入h EGF(最高刺激浓度),空白对照组加不含小牛血清的培养液 10ml/皿,入培养箱继续培养,分别于12h、24h、36h在倒置显微镜下观察空白对照组和hEGF组的EC9706细胞增殖情况和形态学变化。

2.4 流式细胞术分析h EGF对 EC9706细胞周期的影响:以 1×106个细胞 /皿的密度接种 EC9706细胞于Φ100mm培养皿中,10ml/皿,共 4皿。于37℃,5%CO2,饱和湿度的CO2培养箱培养 24h,弃旧培养液,加入不含血清培养液 10ml/皿,饥饿细胞 24h,3皿加入含h EGF(最高刺激浓度)无血清培养液,1皿空白对照加入无小牛血清的培养液,10ml/皿,均入培养箱继续培养。hEGF组三皿分别在 12h、24h、36h时间点收集,空白无血清对照组在 24h时间点收集。在相应时间点以3ml/皿 Trypsin消化,并收集入15ml离心管中,1000rpm×10min离心,弃上清液,加入PBS 2ml,重悬细胞,1000rpm×5min离心,重复 1次。弃掉 PBS,加入PBS 100μl以微量移液器吹打混匀,避免气泡产生,加入70%乙醇固定细胞,放入4℃过夜。待 4管细胞均收集完毕,将固定细胞以 200g×5min离心,弃掉乙醇,并在 3ml预冷的PBS中重悬细胞,静息 1min,200g×5min,重复 1次。弃掉 PBS,依次加入PBS 850μl,10mg/ml RNase A 10μl,1% TritonX-100 100μl,1mg/ml PI 40μl,37℃下避光孵育5min。用400目筛网过滤细胞,上流式细胞仪用Cellquest Pro进行细胞周期分析,并用Modfit LT细胞周期分析软件分析结果,得出不同组别细胞在各细胞周期的百分比率。

结 果

1 h EGF对人食管癌EC9706细胞增殖刺激的量效关系,见表1、图1。

表1 不同浓度 EGF对 EC9706细胞增殖的影响(MTT法)(±sD)

表1 不同浓度 EGF对 EC9706细胞增殖的影响(MTT法)(±sD)

增殖率比较:与200ng/ml浓度时相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

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图1 不同浓度 EGF对 EC9706细胞增殖影响的关系

从表1和图1可以看出,12.5ng/ml到 400ng/ml 6个梯度浓度的细胞培养 24h,细胞生长 OD值总体随着浓度的升高而增加,提示细胞数目增多,在 200ng/ml浓度时,OD值达峰值,与空白对照孔细胞相比,增殖率为51.8%,到 400ng/ml浓度时,增殖率下降,提示细胞增殖饱和。组间增殖率比较,在200ng/ml浓度时,增殖率与其他浓度时相比,分别提示显著性差异(P＜0.05)和极显著性差异(P＜0.01),提示此浓度时 h EGF对 EC9706细胞刺激作用最明显。

2hEGF对人食管癌 EC9706细胞增殖刺激的时效关系,见表2、图2。

图2 h EGF(200ng/ml)对 EC9706细胞增殖影响时效关系

表2 不同时间h EGF(200ng/ml)对 EC9706细胞增殖的影响(MTT法)(±sD)

表2 不同时间h EGF(200ng/ml)对 EC9706细胞增殖的影响(MTT法)(±sD)

增殖率比较:与24h时间点相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

24 1.696±0.131 2.651±0.112 56.3±1.9 36 1.327±0.098 1.857±0.057 40.1±1.5Δ 48 0.916±0.102 1.062±0.063 16.0±2.3*

从表2和图2可以看出,以同一h EGF浓度 200ng/ml作用的EC9706细胞在 12h与空白对照组相比即有小幅度的增殖,增殖率为18.9%;在此后一直到24h,可以看出细胞增殖呈大幅度上升,到 24h时间点达到峰值 56.3%,两时间点比较具有极显著性差异(P＜0.01);此后的36h、48h,细胞增殖呈显著下降趋势,分别与24h时间点比较,具有显著性差异(P＜0.05)和极显著性差异(P＜0.01)。提示在 24h时间点,hEGF对EC9706细胞的刺激作用最强。

3 h EGF对人食管癌 EC9706细胞增殖和形态的影响,见图3。

图3 h EGF对 EC9706细胞增殖和形态的影响

在倒置显微镜下观察,空白无血清对照组细胞呈扁平多角形,具有典型的上皮型细胞生长特性,随饥饿时间延长,逐渐有细胞形态变圆、并有透亮区,呈脱壁状态。12h EGF组镜下观察可见EGF(200ng/ml)组细胞密度高于空白对照组,细胞呈长梭形改变,有较长突起,互相连接成网状,细胞之间连接不甚紧密,24h细胞连接紧密,数目明显多于12h EGF组,均呈贴壁生长,继续呈长梭形改变,36h EGF组可见贴壁细胞有少量呈圆形改变,细胞周缘有透亮区,逐渐有细胞脱壁,细胞数目显著减少,镜下单个细胞呈透亮状态。

表3 h EGF刺激的EC9706细胞周期分布(%)(±sD)

表3 h EGF刺激的EC9706细胞周期分布(%)(±sD)

S+G2 M期细胞百分率比较:与24h时间点相比,* P＜0.01;Δ P＜0.05

h EGF(36h)60.10±1.02 15.62±1.53 24.29±2.58 39.66±1.73Δ

4 h EGF对人食管癌 EC9706细胞周期的影响:从四组的细胞周期 FCM分析结果来看(表3),h EGF三组细胞 S+G2 M期细胞比率均明显高于空白对照无血清组,细胞周期中 S+G2M期的比例反映了细胞群体中细胞增殖的程度,24h收集的h EGF刺激细胞 S期比率较之空白对照和h EGF12h、36h显著升高。从S+G2 M期分析,24h的hEGF组与空白对照相比,百分率增高 47%以上,这与MTT检测结果一致。24h时间点与其他三个时间点比较,具有显著性差异(P＜0.05),提示 24h时hEGF促进细胞过渡到增殖周期的数目达到峰值。

讨 论

EGF是体外最强的促表皮细胞生长因子之一,能诱导蛋白质中酪氨酸残基磷酸化水平增高,提高细胞内代谢水平。在肿瘤的发生、发展过程中,EGF作为一种重要的丝裂原,与其受体结合后可激活多种信号转导通路来调节细胞的生长、增殖及分化[2]。近年的研究表明,EGF与肿瘤的发生、发展密不可分。

我们以 24孔板种植细胞,MTT法检测了细胞增殖情况。在较低浓度时,细胞生长受到抑制,推测由于EGF浓度较低,各细胞之间膜表面受体 EGFR出现受体竞争性抑制;当浓度达到 200ng/ml时,细胞增殖率达到 51.8%,提示此浓度的h EGF能刺激细胞较明显的增殖。

EGF作为有丝分裂源性生长因子,对肿瘤细胞的形态影响非常明显,可以看到细胞在被刺激 12h后为长梭型改变,并伸出触角状细胞突起,呈现迁移能力的增强。在24h时EGF对细胞刺激增殖能力最强,此时细胞迁移能力活跃,细胞以减弱细胞贴壁状态来完成增殖细胞的转移,细胞继续呈长梭形改变,有较长突起。细胞由扁平的多角形上皮型细胞转变成长梭形,这种细胞形态的转变,即上皮细胞-间叶样变(Epithelialmesenchymal transition,EMT),可以视为细胞侵袭的一种标志,有利于肿瘤细胞的浸润和转移[3]。

细胞周期(Cell cycle)是指亲代细胞分裂结束到子细胞分裂结束之间的间隔时期。一个典型的细胞周期有 4个期即 G1-S-G2-M构成,并受到胞内外信号传导途径及反馈环路的调控。细胞周期调控异常是癌变的重要机制。恶性肿瘤细胞的周期调控失控,使细胞分化受阻,处于过度增殖状态[4]。细胞周期中S+G2M期的比例反映了肿瘤细胞群体中处于增殖阶段的数量,从一定程度上代表了细胞增殖状态[5]。我们以 200ng/ml浓度观察了hEGF刺激的EC9706细胞周期的变化。以流式细胞仪分析了空白对照、EGF(12h)、EGF(24h)、EGF(36h)的细胞周期变化:EGF刺激细胞 12h后,S+G2M期细胞比率比空白对照高出 6.9%,到 24h时,S+G2M期增高 47%,其中 S期在达到 30%,提示hEGF刺激细胞由 G1期过渡到 S期,36h时,S期、G2M期以及S+G2 M期均比24h明显下降,提示h EGF刺激细胞增殖在24h达峰值。

我们的实验结果表明,hEGF能够刺激 EC9706细胞由生长抑制的G1期过渡到 S期,从而达到促增殖作用。有关h EGF通过何途径引起细胞的增殖,是否涉及到蛋白质信号转导通路的调节机制?我们将进行更深入的研究。

[1] Ozawa S,Kitagawa Y,Kitajima M.Molecular alteration sin esophageal cancer.Nippon Geka Gakkai Zasshi,2002,103(6):457-462.

[2] 刘友平,丁慧荣,吴民泸,等.高浓度 EGF对小鼠肝细胞信号转导的动力学研究.陕西医学杂志,2005,34(6):643-649.

[3] 马常慧,陈海滨.肿瘤坏死因子受体 I的信号传导与肿瘤的关系.汕头大学医学院学报,2008,21(1):58-60.

[4] 刘中宏,郑长青,喻卫红.Survivin短发夹状 RNA对结肠癌 SW480细胞增殖和细胞周期的影响.肿瘤学杂志,2008,11(3):186-189.

[5] 王爱红,王明全,庞秋霞,等.番茄红素对乳腺癌 MDAMB-231细胞周期和增殖的影响.陕西医学杂志,2008,37(11):1482-1484.