血管内皮生长因子、微血管密度和促红细胞生成素在子宫腺肌病中的作用探讨

第四军医大学西京医院妇产科(西安 710032)

刘朵朵 王宝玲*

子宫腺肌病(Adenomyosis,AMS)与肿瘤一样依赖于血管生成(Angiogenesis),血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种关键的促血管生成因子,微血管密度(Microvascular density,MVD)则是反映血管生成的定量指标,促红细胞生成素(Erythmpoietin,EPO)是参与调控血管生成的血管生长因子,广泛地参与了多种细胞的生长和凋亡等各种生理和病理过程。本研究观察V EGF、MVD及EPO在子宫腺肌病子宫内膜中的表达,以探讨其在该疾病发生发展中的作用。

材料与方法

1 材料选择 随机抽取 2004～2008年陕西省妇幼保健院收治的子宫腺肌病患者行开腹或腹腔镜手术取异位内膜标本 40例作为研究组,患者年龄 23～46岁,其中增生期21例,分泌期19例。同期随机抽取因各种良性疾病行开腹或腹腔镜手术取子宫内膜标本 39例作为对照组,患者年龄24～49岁,其中增生期20例,分泌期19例。两组标本术后均经病理证实,且在年龄、内膜分期方面的差别比较无统计学意义(P＞0.05),术前6个月均未使用过激素类药物和未放置宫内节育器。

2 方 法

2.1 取材:实验组手术时取腺肌病病灶组织 1份,对照组手术时取正常子宫内膜组织 1份,立即用10%甲醛固定,常规脱水及石蜡包埋,每份标本常规行HE染色后光镜下观察组织学形态,筛选组织标本。用APES进行防脱片处理,切片厚度为4μm,捞片后置烤箱 60℃,2h取出,切片脱蜡至水。

2.2 免疫组织化学检测:采用免疫组化 SABC法,实验步骤按试剂盒说明进行,以微波枸橼酸盐进行抗原修复,DAB显色,同时用 PBS代替一抗作为染色的阴性对照。VEGF、MVD检测用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照,EPO检测用已知的EPO染色阳性的胎儿肾脏组织切片作为阳性对照。本研究一抗选用VEGF多克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体(武汉博士德生物工程公司提供)或鼠抗人CD34单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)。SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。

2.3 结果判定:高倍显微镜下全面观察每张切片,随机选择 5个具有代表意义的高倍视野:VEGF检测:采用上海山富科学仪器有限公司 Biosens Digital Imaging System进行分析,用平均灰度反映阳性强度;MVD检测:计数5个高倍视野所有染色的微血管,取其平均值作为该切片的MVD;EPO检测:高倍显微镜(10×40)下观察该 5张切片视野中细胞着色情况,胞质、胞核出现黄色或棕黄色者为阳性细胞。综合阳性细胞所占比例和染色强度进行半定量判定,参照文献[1]作为评分标准。计算阳性细胞百分数(5个视野的平均数),无表达者为阴性(0分),1%～15% 者为可疑阳性(1分),16%～50%者为弱阳性(2分),51%～85%者为阳性(3分),86%～100% 者为强阳性(4分)。按公式[(阳性细胞表达强度×阳性细胞百分数)/2]计算该标本的阳性指数。

3 统计学方法 应用 SPSS11.5统计学软件进行处理,所有数据以平均值±标准差(±s)表示,计量资料两均数差异比较采用t检验或t’检验。

结 果

VEGF、MVD及EPO在两组子宫内膜中的表达结果,见附表。由附表可见,在整个月经周期中腺上皮细胞均有 VEGF表达,在间质细胞中只有散在表达。VEGF腺肌病组在增生期及分泌期异位内膜中的表达与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。MVD腺肌病组在增生期及分泌期异位内膜中的表达与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。EPO在腺肌病组中以阳性或强阳性表达为主,棕黄色颗粒集中于胞质,胞核少量表达,明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P＜0.01);腺肌病组子宫内膜的阳性指数明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。

附表 VEGF、MVD及EPO在两组子宫内膜中的表达比较(±s)

附表 VEGF、MVD及EPO在两组子宫内膜中的表达比较(±s)

与对照组比,*P＜0.05,△P＜0.01

对照组 39 42.16±0.52* 54.26±0.32* 13.8±1.20* 21.8±1.16* 4.08±1.52△ 4.27±2.12△

讨 论

子宫腺肌病(Adenomyosis,AMS)患者与多次妊娠和分娩时子宫壁创伤和慢性子宫内膜炎等刺激局部血管增生,利于子宫内膜组织侵入子宫肌层,并与高雌激素水平有关。血管生成不仅在子宫内膜的生长修复中起作用,而且对子宫内膜异位症(EMT)的发生发展也有重要作用。促使血管生成的因子有V EGF,FGF-2(纤维细胞生长因子-2),IL-8(白细胞介素-8),EGF(表皮生长因子)和Epo(促红细胞生成素)[2]等。其中VEGF能刺激血管生成,被认为是作用最强的促血管生成因子[3],推测其有可能通过自分泌或旁分泌的方式调控着异位内膜的生长、种植和发展。

VEGF主要由巨噬细胞分泌是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原,最先从肿瘤细胞分离出来,是一种结合肝素的二聚体蛋白,其糖蛋白单体以二硫键结合成二聚体才有活性,是通过酪氨酸激酶传导通路发挥作用的。现已证实VEGF及其家族成员不单在肿瘤血管生成,在其它生理和病理的血管生成中都是必不可少的诱导因子。VEGF在胚胎发育、女性生殖周期、伤口愈合等正常生理过程和肿瘤、炎症等病理生理过程中均是调控血管生成的关键细胞因子。经研究发现VEGF的生物学作用有:①特异地促进血管内皮细胞有丝分裂和血管生成。②体外无血清培养内皮细胞时作为生长因子促进 Bcl-2和AI等抗凋亡蛋白表达。③促进纤溶酶原激活物、金属蛋白酶和间质胶原酶的表达,致使细胞非基质降解和肿瘤细胞扩散。④增加血管的通透性和血浆蛋白外渗,为血管内皮细胞和肿瘤细胞生长提供良好的物质基础。其它血管生成因子的血管生成作用全部或部分通过增强VEGF的表达及生成作用来实现。本研究结果发现,子宫腺肌病异位内膜中VEGF的表达无论在增生期还是分泌期均明显高于对照组,提示异位内膜与正常子宫内膜有明显的不同,VEGF的过度表达可能与这种内膜腺体及间质的迁移生长有密切关系。

MVD是评价血管生成的指标,CD34为血管内皮细胞的特异性标记物[4],它的表达有助于进行微血管密度(MVD)的定量分析,反映子宫内膜新生毛细血管的生长情况。子宫内膜组织中MVD越高说明新生毛细血管越丰富。本研究发现子宫内膜异位症在位内膜与正常子宫内膜中均有 CD34的表达,但在异位内膜 CD34明显高于正常内膜,提示子宫腺肌病异位内膜一旦脱落逆流,则具有较强的微血管增生能力,有利于异位种植生长。子宫腺肌病发生发展与内膜组织的侵袭及血供的支持密切相关,此过程受多种细胞因子及蛋白水解酶的调控。

EPO是一种糖蛋白激素,由 165个氨基酸组成,早期由胎肝产生,后逐渐转移至肾脏产生,成年后主要由肾小管间质细胞分泌。作为一种细胞因子广泛地参与了多种细胞的生长和凋亡等各种生理和病理过程,EPO其作用也不仅仅是促进红系细胞的发育,而且参与了抗凋亡、抗缺氧、促进新生血管生成等病理生理学过程。本研究结果显示,腺肌病患者异位内膜腺上皮EPO的表达强度明显高于对照组,而且 EPO主要集中于子宫内膜腺体细胞,这与韩燕华等[5]报道相似,推测EPO的这种异常增高可能参与了腺肌病的发病过程。子宫腺肌病患者异位内膜可能因 EPO过度表达而表现出比正常子宫内膜更强的血管生成能力,腺肌病患者 EPO表达增强提示腺肌病中血管生成处于较活跃的状态,子宫内膜间质血管渗透性增加,并导致间质水肿和纤维素沉积,可以诱导血管生成,为子宫内膜侵入子宫肌层创造条件,异位病灶具有很强的血管生成能力得以存活,使异位内膜获得血供而进一步侵袭、发展,病灶不断扩大,加速异位内膜的种植。

我们的研究表明,VEGF、MVD和EPO参与调控血管生成,在子宫内膜侵袭种植及新生血管形成网络过程中起重要作用,它在组织中的表达反映了该组织的血管生成活性程度,与子宫腺肌病的发生发展关系密切。

[1] Watanabe H,Kanzaki H,Narukawa S.Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during themenstrual cyclein relation to endometrial cell apoptosis[J].Am JObstet Gynecol,1997,176:360-368.

[2] Jaquet K,Krause K,Tawakol-Khodai M.Erythropoietin and V EGF exhibit equal angiogenic potential[J].Microvasc Res,2002,64(2):326-333.

[3] Li HM,Zhao AZ,Dou HF,etal.Expression of VEGF in hepatic hemangioma and its clinical implication[J].Fourth Mil Med Univ,2002,23(7):606-607.

[4] Kimura H,Fnakajima.Kingiogensis in hepatocellular carcinoma as evaluated by CD34 immunohistochemistry[J].Liver,1998,18:14-19

[5] 韩燕华,周应芳,郑淑蓉.子宫腺肌病患者血管内皮生长因子表达的研究[J].中华妇产科杂志,2002,9:539-541.