白藜芦醇对裸鼠移植性肝癌的抑制作用△

陕西省人民医院肝胆外科(西安 710068)

孙中杰 余海波 张 煜 刘晓刚 杜立学

白藜芦醇(Resveratrol,Res)具有降血脂、清除氧自由基、调节机体免疫力、抗肿瘤作用。它对肿瘤的发生、发展多阶段均有明显的抑制效果。Whitsett等[1]研究发现白藜芦醇可以显著降低小鼠乳腺癌的发生率,Res能抑制小鼠肝癌细胞 H22的生长[2]。在本实验中我们通过构建人肝癌细胞系 Hep G2裸鼠皮下移植瘤的模型,观察白藜芦醇对移植瘤的抑制作用。

材料和方法

1 实验材料 白藜芦醇Sigma公司产品,CD34单抗 Zymed公司产品;人肝癌 Hep G2细胞,西安交通大学第一附属医院肝胆外科实验室传代保存;BALB/c(nu/nu)雄性裸小鼠由第四军医大学实验动物中心提供,雄性,6周龄,体重18～22g,在该中心 SPF级(Specific pathogen free)环境中饲养。

2 方 法

2.1 白藜芦醇对裸鼠移植性肝癌的抑制作用:18只接种人肝癌细胞 Hep G2移植瘤裸鼠模型随机分为3组,每组 6只:50mg/kg Res组,生理盐水(NS)对照组,1%DMSO对照组。接种后第10天开始,每间隔2天腹腔给药 1次,每只裸鼠腹腔注射大约 0.2～0.3ml,共注射10次。观测指标:①肿瘤体积:每次给药前以游标卡尺测量皮下肿瘤直径,以肿瘤最大径与肿瘤最小径乘积(mm2)代表肿瘤大小。②肿瘤重量:末次给药 24h后,脱椎处死裸鼠,解剖摘除皮下移植瘤,尽量剥离移植瘤表面包膜,分析天平称重。

2.2 测定肿瘤微血管密度(Microvessel density,MVD):瘤组织切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡水化;0.3% H2O2-甲醇溶液室温下浸泡后,经微波修复抗原,以 10%山羊血清封闭切片,排除组织和一抗发生非特异性结合。按步骤先后滴加 1∶50稀释的CD34一抗、生物素化二抗和SABC液,用磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照;滴加新鲜 DAB显色液至切片,避光显色后终止反应;梯度乙醇逐级脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,光镜下观察并摄影。对各组裸鼠肿瘤组织CD34染色切片进行MVD计数:染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞群,只要它们与邻近微血管、肿瘤细胞或其它结缔组织分开,就视为一个微血管,同一个血管的“头”和“尾”正好在一个切面上,也作为两个微血管计算,血管腔和红细胞不作为判断血管的标准。先在100倍视野下观察整张切片的血管分布情况,确定肿瘤区域内微血管最密集的5个区域,即“热点”。再在200倍光镜下计数每个区域内的血管数,取 5个区域的平均值,作为该只裸鼠肿瘤的MVD。

2.3 统计学分析:全部数据经SPSS13.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析并行两两比较,以 P＜0.05作为具有显著性差异的标准。

结 果

1 Res对裸鼠移植瘤瘤体大小的影响:在移植瘤生长的早期阶段(前 2周),50mg/kg Res组裸鼠移植瘤瘤体与DMSO组及NS组裸鼠比较并无明显差别;2周后移植瘤开始进入快速生长期,开始出现差别,到24d时,50mg/kg Res组处理组裸鼠瘤体明显小于NS组(P＜0.05);DMSO组与NS组比较前者的瘤体较小,但没有统计学意义(图1)。

图1 Res对裸鼠移植瘤瘤体大小的影响

2 Res对裸鼠移植瘤瘤体重量的影响:50mg/kg Res组瘤体重量明显较 NS组轻,有显著差异(P＜0.01);0.1%DMSO组及NS组瘤体重量无明显差异,无统计学意义(P=0.51)(图2)。

图2 Res对裸鼠移植瘤瘤体重量的影响

3 Res对 Hep G2细胞裸鼠移植瘤组织中 MVD的影响及其与肿瘤体积的相关性:免疫组化结果显示,50mg/kg Res处理组 MVD为18.5±3.2,且呈棕褐色条索状,微血管分布较稀疏,与生理盐水对照组的MVD值(44.2±4.1)相比明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),表明 Res具有抗 Hep G2细胞裸鼠移植瘤血管生成的作用。经 Res作用后,裸鼠移植瘤组织中MVD明显减少的同时肿瘤体积亦明显减小,经统计学分析,移植瘤组织MVD与相对肿瘤体积呈明显正相关(r=0.715,t=4.797,P＜0.01)。

讨 论

肿瘤的治疗是一个世界性难题,寻找高效、低毒的抗癌药物是目前研究的重要课题之一。研究发现白藜芦醇具有心血管保护作用,对多种肿瘤均有抑制作用,可以抑制小鼠皮肤癌[3],人乳腺上皮癌[4],前列腺癌[5]的生长增殖,能诱导人白血病细胞 HL-60细胞的分化[6]。最近还发现白藜芦醇可抑制小鼠肺癌(LLC)移植瘤的生长、转移,2.5～10mg/kg的白藜芦醇可以使肿瘤体积减少 42%,重量减少 44%,肺转移下降56%[7]。前期的实验发现白藜芦醇在体外能抑制Hep G2细胞的增殖,本研究发现 50mg/kg Res用药两周后,瘤体大小较对照组为小,显示出 Res对裸鼠移植瘤亦有抑制作用;移植瘤裸鼠观察结束时瘤体重量的改变,更加说明了Res按 50mg/kg给药对裸鼠移植瘤生长具有较明确的抑制效应。这与Res抑制其它肿瘤的研究结果相似[2]。因为Res是疏水性物质,不易溶于水,因此我们加用了助溶剂 DMSO助溶并作对照。在实验中,我们发现 0.1%DMSO组与NS组瘤体大小比较差异不明显,没有统计意义。

肿瘤血管生成是指血管内皮细胞从现有的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程,有多种生长因子、胞外基质成分、蛋白水解酶和细胞粘附分子参与此过程[8]。恶性肿瘤发生侵袭和转移是肿瘤治疗失败的主要原因[9],而肿瘤血管生成在其转移的起始及终末阶段发挥着重要作用[10]。血管新生和丰富的血流是肿瘤迅速生长和发生转移的病理基础和重要条件。故如何抑制早期血管生成、破坏肿瘤血管已经成为肿瘤治疗研究的热点和突破口。有研究表明,对肿瘤组织中已经存在的血管和/或正在血管生成的肿瘤进行干预,阻断诱导血管生成的通路,能够有效地抑制肿瘤增殖和生长,使其处于休眠状态[11]。近年来研究表明,血管生成是包括 HCC在内的许多实体瘤生长和转移的关键因素[12]。目前认为肿瘤组织 MVD作为间接测量肿瘤血管生成的一项指标,与多种肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移,以及患者预后有关[13]。前期的实验发现 Res能下调 Hep G2细胞 VEGF m RNA及蛋白的表达,本研究发现经 Res处理的肿瘤比生理盐水组肿瘤苍白,这可能与其抑制了肿瘤血管生成有关。进一步检测裸鼠移植瘤组织MVD发现,Res能够明显降低裸鼠皮下移植性肝癌组织MVD,且肝癌组织MVD与裸鼠相对肿瘤体积呈正相关。这提示Res可以抑制肿瘤组织中的新生血管的形成,降低肿瘤组织MVD,遏制肿瘤生长。Res可能具有抑制肝癌细胞生长及侵袭转移的作用。

[1] Whitsett TG Jr,Lamartiniere CA.Genistein and resveratrol: mammary cancer chemoprevention and mechanisms of action in the rat[J].Expert Rev Anticancer Ther,2006,6(12):1699-1706.

[2] 孙中杰,于良,潘承恩,等.白藜芦醇对小鼠肝癌细胞H22的抑制作用.陕西医学杂志,2004,33(11):1031-1033.

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