磷酸肌酸钠对小鼠移植性S180肉瘤生长的影响△

河北医科大学第四医院肿瘤内科(石家庄 050017)

魏素菊 刘凝华 韩文峰

蒽环类化疗药是肿瘤内科应用最为普遍的药物之一,但其明显的心脏毒性往往不仅影响了其临床规范应用,同时也影响了患者的生活质量。CP是一种广泛应用于心脏内科及心脏外科的一种心肌保护剂,其作用机制是为机体的高耗能细胞提供能量。但由于肿瘤组织的代谢,该药物对肿瘤组织的作用尚不明确故其在肿瘤内科的辅助治疗中还存在疑虑。本文就通过磷酸肌酸钠对转移性小鼠S180肉瘤的PCNA蛋白及Bcl-2和Bax蛋白表达的测定从而研究其对小鼠S180转移瘤的增殖及凋亡的影响。为该药物在肿瘤辅助治疗中的应用提供实验依据。

材料与方法

1 主要药物、试剂与仪器设备 磷酸肌酸钠购自海口奇力制药有限公司,为白色粉末,1.0g/支,批准文号:H20053431.PCNA。鼠抗人单克隆抗体及羊抗鼠FITC-Ig G二抗试剂盒均为Sanat Cruz公司产品。DAB显色试剂:河北博海生物工程有限公司产品,鼠抗人单克隆抗体(BCL-2):北京中杉金桥生物有限公司产品。鼠抗人单克隆抗体(BAX):北京中杉金桥生物有限公司产品。二抗试剂盒:北京中杉金桥生物有限公司产品。

2 细胞株与实验动物 鼠源性 S180肉瘤细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。昆明种雄性小鼠 60只,清洁动物,3周龄,体重20～22g,购自河北医科大学实验动物中心,合格证号:SCXK(冀)2003-1-003。

3 小鼠S180转移瘤造模 无菌条件下抽取接种7d荷瘤小鼠的腹水,用生理盐水洗涤 2遍后调整细胞浓度为1×107个/ml,于小鼠右前肢腋下皮下接种,每只 0.2ml。随机分为生理盐水对照组及磷酸肌酸钠低(4mg/d)、中(8mg/d)、高(16mg/d)剂量组。接种次日开始连续腹腔给药7d,终止治疗后观察1d,各组动物同时全部处死,取出瘤体并称重后计算抑瘤率并分别保存于70%酒精及液氮中。抑瘤率(%)=(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100%(公式一)

4 流式细胞仪测定 凋亡率的检测:75%乙醇固定瘤组织,研磨、过铜网后制成单细胞悬液,调整细胞密度为1×106/ml。取 0.1 ml加入碘化丙啶 4℃冰箱避光染色 30 min,500目铜网过滤后上机检测凋亡率。

PCNA蛋白的测定:将用 70%冷乙醇固定的肿瘤组织用生理盐水研磨后制成单细胞悬液,取0.1 ml(细胞密度为1×106/ml),加入0.1 ml 1∶50稀释的一抗室温孵育 30min,加入PBS洗涤 1次,弃上清后加入FITC-IgG二抗工作液100μl,避光、室温孵育30min。加入PBS离心后弃上清,经500目铜网过滤后上机检测,同时设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照。PCNA蛋白表达含量以平均荧光强度(均道值)表示。

均道值=lg(x-Mode)×340(公式二)

5 免疫组织化学检测小鼠肿瘤组织中 BCL-2和BAX蛋白定性表达

5.1 链霉素抗生素蛋白-过氧化酶连接(SP)法染色:10%中性甲醛固定肿瘤组织 4～10 h后,梯度乙醇系列脱水,石蜡包埋后4um连续切片,二甲苯及梯度酒精脱蜡至水,PBS(ph7.4)液浸泡 5min×2,组织抗原微波修复,冷却,甲醇过氧化氢修复 20min,PBS液泡洗5min×2,擦玻片后置于是湿盒中,血清(A液)封闭,温箱中孵育 45min,滴加一抗,玻片置于湿盒内冰箱冷藏过夜,PBS液 5min×2,加二抗,入温箱 30min后,PBS液 5min,加三抗,入温箱 30min后,PBS液 5min×2,DAB显色,苏木精复染,脱水,晾干,中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗,经上述步骤染色,作为阴性对照。

5.2 结果判定:Bcl-2和Bax阳性表达均为细胞胞浆呈棕黄色颗粒状染色。免疫组化评分标准:在切片中随机选 5个高倍视野(400倍),循序在 1000个细胞中计数阳性细胞的个数,并由此得出阳性细胞的百分比。表达水平用阳性标记指数(Lableling index,LI)表示[11]。LI(%)=(染色阳性细胞数 /细胞数)×100%(公式三)

结 果

1 各组平均瘤重和抑瘤率,见表1。CP16mg/d组小鼠平均瘤重较对照组减轻,差异有统计学意义(P＜0.05),但是其余各组间平均瘤重差异不显著(P＞0.05)。CP16mg/d组抑瘤率为11.60%,CP8mg/d组抑瘤率为6.38%,CP 4mg/d组抑瘤率为4.25%。

表1 不同剂量 CP对小鼠 S180移植瘤瘤重的影响(n=15,±s)

表1 不同剂量 CP对小鼠 S180移植瘤瘤重的影响(n=15,±s)

*与对照组相比,P＜0.05

CP 16mg/d组 80mg/ml 0.2ml 2.22±0.30* 11.60%

2 不同剂量 CP对小鼠 S180移植瘤组织中细胞凋亡率的影响:FCM检测结果显示 CP16mg/d组细胞凋亡率为13.21±1.15%,高于CP8mg/d组、CP4mg/d组及对照组但各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 不同剂量CP对小鼠S180移植瘤组织中PCNA蛋白表达的影响,见表2。不同浓度CP组 PCNA蛋白的表达均低于对照组,较对照组相比 CP16mg/d组差异有显著性(P＜0.05),而CP4mg/d和CP8mg/d差异不明显(P＞0.05)。

表2 不同剂量CP对小鼠 S180移植瘤组织中PCNA蛋白表达的影响(n=15,±s)

表2 不同剂量CP对小鼠 S180移植瘤组织中PCNA蛋白表达的影响(n=15,±s)

*与对照组相比,P＜0.05

CP 16mg/d组 313.39±7.04*

4 免疫组织化学检测结果:免疫组化结果显示:Bcl-2和Bax蛋白均以细胞浆呈棕黄色颗粒状染色的细胞为阳性表达细胞。结果显示随着 CP剂量的增加Bcl-2的表达及Bax的均有减弱趋势。Bcl-2/Bax在CP16mg/d组(0.31±0.11%)最低,CP8mg/d组(0.31±0.09%)、CP4mg/d组(0.32±0.12%)与对照组(0.34±0.13%)比较也呈降低趋势,但各组间的差异均无显著性(P＞0.05)。

讨 论

随着新药物的应用,目前恶性肿瘤的治疗前景已有了很大的改观。但随之而来的是化疗药物的毒副作用,有时它甚至超过治疗本身的作用。磷酸肌酸(Phosphocrentine,Pcr)是参与细胞能量代谢的重要物质之一,在细胞中的含量可达 2～30 mmol/L,它的主要生理功能在于补充体内高耗能细胞内的消耗的ATP,同时 CP能够抑制细胞膜上5’-核苷酸酶的活性,稳定细胞内腺苷酸含量,从而为细胞内能量代谢创造条件。目前已广泛应用于各种心脏疾病的治疗[1,2]。为了研究 CP应用于化疗心脏毒性的预防及治疗同时其对肿瘤生长的影响,设计并作了如上实验,通过流式细胞分析技术检测小鼠 S180移植瘤组织中 PCNA蛋白的表达及应用免疫组织化学法分析小鼠 S180移植瘤组织中Bcl-2和Bax的表达来研究CP对小鼠S180移植瘤生长的影响。

PCNA是一种 36k D的核蛋白,是 DNA多聚酶的辅助蛋白,存在于细胞核内不同部位,是评价细胞增殖的重要指标。PCNA在细胞的G1晚期表达增加,在 S期达高峰,然后下降[3,4]。检测其在细胞中的表达,可作为评价细胞增殖状态的一个指标[5]。本实验结果显示,经 CP治疗后 PCNA蛋白表达降低,以 CP 16mg/d剂量组为最佳,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05),而 CP4mg/d和CP8mg/d与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明高剂量的CP抑制肿瘤生长与抑制小鼠 S180移植瘤组织中 PCNA蛋白的表达有关。

细胞凋亡的调控是一个十分复杂的多基因作用过程,在这一基因调控网络中,Bcl-2基因家族起关键作用。目前已知Bcl-2家族成员包括:Bcl-2/Bax、Bcl-XL/Bcl-Xs、Bak等,它们相互作用,参与调控细胞的凋亡,其中以 Bcl-2/Bax的作用尤为重要。Bcl-2家族可以分为两类:一类是抗细胞凋亡基因,代表基因是 Bcl-2基因,其主要生物学功能为延长细胞生命并增强细胞对凋亡刺激因素的抗性;另一类是促细胞凋亡基因,代表基因是 Bax基因,其促进凋亡主要通过拮抗Bcl-2的功能来实现。Bcl-2、Bax均可形成自身同源二聚体或与对方形成异源二聚体,并以二聚体形式参与细胞凋亡的过程。若 Bcl-2同聚体形成则抑制细胞凋亡,而 Bax同聚体形成则诱导细胞凋亡,但当Bcl-2和Bax形成异二聚体复合物时则抑制 Bcl-2的抗凋亡功能。因而认为Bcl-2和Bax之间的比值决定了细胞是否接受诱导凋亡的信号[6～10]。本研究发现 CP给药组小鼠 S180移植瘤组织中Bcl-2/Bax比值无明显变化,说明不同浓度的CP对小鼠 S180移植瘤细胞的凋亡无影响。

本实验通过对 CP治疗后小鼠 S180移植瘤的研究发现,治疗量的CP不影响小鼠 S180移植瘤的生长,而高剂量的CP可以抑制肿瘤的生长。因此为磷酸肌酸应用于肿瘤的辅助治疗提供了实验依据。

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