荆防败毒颗粒治疗鸡新城疫的临床试验

王艳萍,董 林,沈志强,郭时金,张 颖,张志美,周春凤

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;2.山东绿都安特动物药业有限公司,山东滨州256600)

目前对新城疫的防治采用鸡新城疫病毒(NDV)疫苗接种,即能收到较好效果,但由于SPF蛋的缺乏,疫苗生产质量、疫苗运输、保存条件和免疫程序的选择、免疫抑制病的发生等因素的影响使NDV疫苗的应用受到一定的影响,尤其在鸡新城疫发生时,防治效果不够理想,使鸡新城疫仍为危害养鸡业的最大疫病之一[1]。为此,山东绿都安特动物药业有限公司与山东省滨州畜牧兽医研究院联合研制了新兽药制剂“荆防败毒颗粒”,为了验证其临床效果,我们进行了以下试验。

1 试验材料

1.1 试验动物 健康21日龄海蓝灰公雏500只,隔离饲养,血清学检验ND母源抗体HI≤2。

1.2 药物 试验药物：荆防败毒颗粒(主要成分：胡薄荷酮、α-蒎烯、薄荷醇),批号 20071210,山东绿都安特动物药业有限公司研制。

对照药物：荆防败毒散(主要成分：荆芥、防风、羌活、独活、柴胡等),批号 20070424,山东绿都安特动物药业有限公司生产。

1.3 毒株 NDV F 48 E8株 购于中国兽医药品监察所。

1.4 抗原及血清 鸡抗F48E8亚型NDV阳性血清、F48 E8亚型NDV标准抗原均由山东省农业科学院畜牧兽医研究所实验室保存。

1.5 鸡胚 9～11日龄SPF鸡胚,购自山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

2 试验方法

2.1 鸡群分组与攻毒 将500只鸡随机分成10组,每组50只,编号并记录每只鸡的体重、生长发育。攻毒：无菌条件下,将F48E8株 NDV 105EID50 1 000倍稀释,0.1 mL/只肌肉注射。

2.2 组别分类

第1～3组：药物预防组(攻毒前3 d分别在饮水中添加“荆防败毒颗粒”1.2 g/d◦只、0.8 g/d◦只、0.5 g/d◦只,连用 3 d)。

第4组：药物预防对照组(攻毒前3 d分别在饲料中添加“荆防败毒散”剂量为1 g/d◦只,连用3 d)。

第5～7组：药物治疗组(攻毒并出现明显症状后,以“荆防败毒颗粒”饮水治疗,剂量为2 g/d◦只、1.5 g/d◦只、0.8 g/d◦只,连用5 d)。

第8组：药物治疗对照组(将攻毒出现明显症状的鸡以“荆防败毒散”治之,2 g/d◦只拌料,连用5 d)。

第9组：空白对照组(即不攻毒,不用药组)。第10组：阳性对照组(即攻毒不用药组)。

2.3 病料的采集与处理[2]该试验共持续15 d,每天观察鸡的临床表现,对各试验组每天用棉拭子随机采10只鸡的咽喉及泄殖腔黏液,将蘸取黏液的棉拭子立即放入 Hank′s中,充分振荡,使黏液分散,3 000 r/min离心15 min,取上清,用于接种鸡胚。

对试验过程中死亡的鸡及试验结束后存活的鸡剖杀,采集心、肝、肺、脾、肾等脏器研磨后 2 000 r/min离心 15 min,取上清,接种鸡胚。

2.4 病毒的增殖 取2.3处理的样品各1 mL分别置于灭菌的2 mL离心管中,之后加入200μL双抗,37℃感作1 h,再用0.45μm 的微孔滤膜过滤除去杂质,滤液接种9～11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,0.2 mL/胚,每个样品接3个胚,同时用生理盐水代替病毒,接种同批鸡胚作为阴性对照,37℃继续孵化,每天照蛋2次并弃去24 h内死胚,无菌收取24～96 h内的鸡胚尿囊液并观察鸡胚病变,采用微量血凝试验(HA)测定其血凝效价。

2.5 1%鸡红细胞悬液的制备 采取健康公鸡血液用2%枸橼酸钠盐水抗凝,放入50 mL的锥形离心管中,加入5倍体积的PBS缓冲(p H值7.4),3 000 r/min离心10 min,吸去上清和淡黄色的白细胞层,5倍体积的PBS缓冲(pH值7.4),3 000 r/min离心5 min弃去上清;重复用PBS洗两遍,重悬至终体积12 mL,放入15 mL有刻度的锥形离心管中;3 000 r/min离心10 min,估计沉淀细胞的体积,稀释到大致所需浓度。

2.6 微量血凝试验(HA) 具体操作步骤如下,在96孔“V”型微量血凝板的1～12孔均加入50μL生理盐水。用微量移液器吸取50μL待检抗原(即尿囊液)加入到第1孔,混匀。从第1孔吸取50μL抗原液加入第2孔,混匀后吸取50μL加入第3孔,如此进行倍比稀释至第11孔,从第11孔吸取50μL弃之,第12孔加入50μL生理盐水作为对照。每孔加入50μL 1%鸡红细胞悬液,在微量振荡器上混匀,室温下静置20～30 min后观察结果。

2.7 判定标准

2.7.1 临床判定标准 轻者：症状出现时间较迟,精神沉郁,采食量略减(10～20分);轻微：排黄绿色粪便,采食、精神正常(30分);重者：症状出现时间早,昏睡,呆立不动或卧地不起,采食量减少或废绝(100分)。剖检存在以下症状,轻微：个别腺胃乳头出血,肌胃局部点状出血,肠道淋巴出血或肿胀,盲肠扁桃体肿胀;中等：乳头间大片出血,肌胃出血,肠道出血,盲肠扁桃体出血;严重：乳头间弥漫性出血,肌胃大面积出血,盲肠扁桃体坏死,泄殖腔弥漫性出血。

2.7.2 用药5 d后判定标准 发病：试验期间,出现鸡新城疫(ND)临床症状和/或尸体剖检有ND特征病变者定为发病;死亡：试验期间死亡,并出现ND临床症状和/或尸体剖检有ND特征病变者,判定为感染死亡;保护：试验期间,预防组未死亡鸡均定为保护;痊愈：受试鸡精神、食欲、粪便均恢复正常;有效：除完全治愈的鸡属于有效外,经用药精神好转,食欲、粪便有所恢复,与对照组比较死亡时间显著延长者,可判定有效;无效：受试鸡用药后精神、食欲、粪便未见好转,甚至加重死亡。

3 结果与分析

3.1 发病及临床防治效果与分析 见表1。

表1 荆防败毒颗粒对鸡人工感染ND的防治效果

攻毒后 24 h第 5、6、7、8、10组即排绿色粪便,72 h 第 5、6、7、8、10 组鸡表现精神沉郁,食欲消失或废绝,羽毛松乱无光泽,垂头缩颈,翅膀下垂,冠和肉髯发绀,眼半闭或全闭,似昏睡状态,排黄绿色或黄白色稀便,嗉囊胀满,从病鸡口中流出酸臭黏液。预防1、2、3、4组于 72 h出现明显症状。

高、中、低剂量治疗组治愈率分别为 90%、88%、72%,药物对照治疗组治愈率为70%,其中高剂量治疗组与中剂量治疗组之间差异不显著(P＞0.05),中剂量治疗组与低剂量治疗组之间差异极显著(P＜0.01),中剂量治疗组与药物对照治疗组之间差异极显著(P＜0.01);高、中、低剂量预防组保护率分别为90%、88%、76%,药物对照预防组保护率为70%,其中高剂量预防组与中剂量预防组之间差异不显著(P＞0.05),中剂量预防组与低剂量预防组之间差异显著(P＜0.01、P＜0.05),中剂量预防组与药物对照预防组之间差异极显著(P＜0.01)。

3.2 血凝试验结果与分析 于给药后第1、2、3、7、10、11、14天采集各试验组鸡的咽喉及泄殖腔黏液,按2.4病毒增殖后取尿囊液用微量法血凝试验(HA)测其血凝效价,结果见表2。

表2 给药后检测血凝(HA)效价(log2)的结果

结果显示,荆防败毒颗粒高剂量治疗组第1天血凝效价为2.9±0.74、2～14 d为0;中剂量治疗组第1天所测得的血凝效价均为2.9±2.60、第2天为2.4±0.84,第3～14天为0;低剂量治疗组仅于给药后前7 d均有血凝效价,且平均效价较高,8～14 d为0;而荆防败毒散治疗组与阳性对照组给药后第1天的血凝效价分别为6.4±0.97、9.9±0.74,给药后第10天的血凝效价为 6.9±0.74、8.3±0.68,一直持续较高水平。试验结束后,采集各试验组活鸡的脏器经处理后鸡胚,96 h后收取尿囊液测得的效价均为0。

3.3 给药后1～14 d采集各试验组鸡咽喉及泄殖腔拭子的排毒情况。见表3。

表3 给药后1～14 d采集各试验组鸡咽喉及泄殖腔拭子的排毒情况

4 结语

由以上结果可知,将荆防败毒颗粒按1.5 g/d◦只和0.8 g/d◦只的剂量饮水给药对鸡新城疫有很好防治效果,为临床防治非典型新城疫提供了方法。

[1] 王玮.中药抗鸡新城疫的临床试验研究[J].山西农业(畜牧兽医),2007,10(1)：21-22

[2] 祝艳华.金丝桃素新制剂在体内对 H9N2和H 5N1亚型禽流感病毒抑制作用的研究[D].兰州：甘肃农业大学动物医学院,兰州畜牧与兽药研究所,2006：25.