防腐生肌膏对创伤应激小鼠TNF-αIL-6及皮质醇的影响

于文会,戈 胜,姜晓文

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

机体在大手术、创伤、重症感染等所致的严重应激状态下,会发生内分泌代谢紊乱,出现肾上腺皮质激素的分泌增多,血糖、血压升高,心率、呼吸加快等应激反应,并引起一系列代谢、营养、免疫等方面的变化,从而影响机体的正常生理功能及创伤愈合。创伤后过强的应激反应性损害,是近年研究的一个重要课题[1]。本研究结合传统中兽医理论,在传统中药方剂防腐生肌散的基础上,以活血化瘀、祛腐生肌药为主药,清热燥湿收脓药为辅药作为组方原则研制的中药防腐生肌膏,应用于动物皮肤创伤模型后有良好的治疗效果。本试验通过考察该制剂对创伤应激小鼠的调节作用,从应激角度揭示其促进创面愈合的机理。

1 材料与方法

1.1 材料 TNF-α(批号：20090720)、IL-6(批号：20090726)及皮质醇放免试剂盒(批号：20090720)均购自北京华英生物技术研究所;γ放射免疫计数器(西安核仪器厂);防腐生肌膏由本教研室自制,其主要成分为血竭、乳香、紫草、三七、连翘、蒲公英、冰片、煅石膏、没药、大黄、黄柏、白芷、赤芍等。

1.2 试验动物及分组 健康雄性KM小鼠90只,体重25 g±2 g,由汉方实验动物养殖所提供。正式试验前将小鼠在环境安静的房间适应性饲养一周后按体重随机分组,设正常对照组(normal control,NC)小鼠10只;创伤应激组(traumatic stress,TS)小鼠40只;创伤应激治疗组(TS+treat)小鼠40只。

1.3 动物模型的建立 参照文献[2]在创伤应激组和创伤应激治疗组小鼠背部正中选择一块面积为2×3 cm2约占小鼠体表面积25%的完整皮肤,用8%硫化钠脱毛,生理盐水洗净擦干,5%碘酊及75%酒精局部消毒后,用尖锐组织剪在脱毛处剪一直径为1 cm圆形伤口,深达肌筋膜,破坏部分肌肉表面筋膜。

1.4 给药方法 造模成功后创伤应激治疗组小鼠皮肤创口涂抹防腐生肌膏,每天2次,厚约1 mm;正常对照组和创伤应激组小鼠不作处理。

1.5 取材及血清指标测定 创伤应激组和创伤应激治疗组小鼠分别于造模后1 d、2 d、3 d、4 d的上午9时眼眶静脉采血约1 mL,每次10只小鼠,血于无菌EP管中4℃静置 30 min,2 000 r/min离心15 min,分离血清,-70℃保存。正常对照组(10只小鼠)采用相同方法于上午9时采血,分离血清。用放射免疫分析法测定血清TNF-α、IL-6和皮质醇的含量。

1.6 统计学处理 试验数据应用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用单因素方差分析处理数据,组间均数比较用最小显著差(Least Significant Difference,LSD)t检验,P＜0.05即认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中TNF-α的影响伤后1 d治疗组 TNF-α水平极显著低于应激组(P＜0.01),TNF-α的分泌明显受到抑制;应激组的TNF-α水平在第1天和第4天出现两个峰值,呈现双峰现象;治疗组TNF-α水平在第2天达峰值后逐渐降低,第4天降至正常水平。

2.2 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中IL-6的影响伤后1 d小鼠血中的IL-6水平有明显升高,并呈逐渐下降趋势,治疗组在第4天已恢复至正常水平;伤后1 d治疗组IL-6水平极显著高于应激组(P＜0.01),其后数天,治疗组逐渐恢复至正常水平,而应激组在实验期间始终高于对照组。

2.3 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中皮质醇(cortisol)的影响 伤后各组小鼠血中皮质醇水平都有极显著的升高(P＜0.01),皮质醇变化呈现双峰现象,在第1天和第3天达峰值,其后逐渐降低,治疗组在第4天降至正常水平;应激组的皮质醇水平在试验期间明显高于治疗组(P＜0.05)。

表1 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中TNF-α的影响(ng/mL,n=10,±S)

表1 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中TNF-α的影响(ng/mL,n=10,±S)

注：与治疗组比较,*：P ＜0.05,**：P＜0.01;与对照组比较,△：P＜0.05,△△：P＜0.01,下表同

组别 1 d 2 d 3 d 4 d TS 1.35±0.12**△△ 0.92±0.08* 1.06±0.10△△ 1.26±0.10**△△TS+treat 0.91±0.09△ 1.14±0.13△△ 1.02±0.05△△ 0.85±0.11 NC 0.78±0.11

表2 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中IL-6的影响(pg/mL,n=10,±S)

表2 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中IL-6的影响(pg/mL,n=10,±S)

组别 1 d 2 d 3 d 4 d TS 99.75±6.95**△△ 87.90±5.67△△ 85.53±6.52**△△ 75.84±4.54*△TS+treat 133.84±8.66△△ 95.45±7.32△△ 68.76±6.38 64.53±3.93 NC 65.50±3.98

表3 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中皮质醇的影响(ng/m L,n=10,±S)

表3 防腐生肌膏对创伤小鼠血清中皮质醇的影响(ng/m L,n=10,±S)

组别 1 d 2 d 3 d 4 d TS 40.89±4.53*△△ 32.45±3.67**△△ 42.21±3.69**△△ 25.94±2.40**△△TS+treat 34.70±2.43△△ 15.58±2.36△ 22.34±2.00△△ 11.94±1.54 NC 9.31±0.81

3 讨论

TNF-α由巨噬细胞产生,能够促进早期炎症反应,提高早期炎症水平;同时它能提高局部成纤维细胞数量,主要通过促进成纤维细胞的有丝分裂,诱导基质的合成与成熟而促进伤口愈合[3]。许多细胞如单核巨噬细胞、活化T细胞和B细胞、上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞、T淋巴细胞等能产生 IL-6。IL-6能诱导B细胞、肝细胞产生免疫球蛋白和急性期蛋白,本身对细胞无直接损害作用,能促进中性粒细胞的活化、聚集,是反映机体炎症与组织损伤的严重程度的重要指标[4]。创伤早期IL-6在激活局部和全身性宿主防御机制中起关键作用,以限制组织的进一步损伤。创伤后巨噬细胞分泌大量的TNF-α、IL-6参与机体过度的炎症反应。Pape H C等[5]对多位重创伤患者研究发现其IL-6水平显著升高;Caatania[6]等对热损伤及创伤的研究也表明应激后TNF-α、IL-6明显增加。TNF-α分泌适量可发挥免疫调节、抗感染作用,但分泌过多可导致机体感染性休克和多脏器功能衰竭[6]。在试验中,创伤后第1天治疗组小鼠的 IL-6水平显著高于应激组,而TNF-α水平显著低于应激组,说明过高的IL-6水平抑制了TNF-α的分泌,而且致伤后 TNF-α、Cor的分泌呈双峰现象,这与众多学者报告一致[7-9]。致伤2 d后,治疗组小鼠 TNF-α、IL-6有不同程度的下降,与创伤应激组比较有显著差异,说明防腐生肌膏具有下调炎性细胞因子的过度表达,减轻过度炎症反应的作用。方剂中的大黄可抑制病理情况下TNFR1、TNFR2表达,降低血浆内 TNF-α水平,抑制TNF-α对肠黏膜上皮细胞的毒性作用[10]。白芷、紫草、蒲公英等有良好的抗炎抑菌作用肾上腺是应激反应的主要器官,创伤等刺激可使促肾上腺皮质激素(ACTH)及由肾上腺皮质分泌的皮质醇释放增多,以后者更为明显,因而临床上将其作为判断应激反应强度的主要指标[11]。许多神经内分泌激素都有免疫调节作用,如生理应激状态下增多的内源性鸦片样多肽β-ET,就是抗体产生的强有力抑制剂,皮质激素也有免疫抑制作用,皮质激素的过度增加必然导致机体对各类细菌及毒素的易感性增强。适度的应激反应可提高机体对应激原的防御和适应能力,当严重创伤等应激原强烈持久作用时,机体将出现过度应激,HPA轴异常亢进,可发生应激紊乱,造成对机体的继发性损伤效应。防腐生肌膏在创伤应激后能抑制皮质醇的过度分泌,调节应激反应强度,这可能与方剂中所含的白芷、冰片、没药等止痛、镇静安神作用有关。

综上所述,以活血化瘀、祛腐生肌为主组成的中药方剂可通过双向调节作用,改善机体的应激反应强度,避免过强应激对机体造成的伤害。

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