测定维生素A含量的两种方法比较

黄成安　张喜金　李斌

[摘要] 目的 通过比较测定维生素A含量的两种不同方法，为维生素A及其制剂的含量测定提供参考，从而建立一种快速、准确、简单的检测方法。 方法 均采用高效液相色谱法测定，沸水浴回流皂化法采用甲醇-水（94∶6）为流动相，检测波长为300nm，色谱柱温度为40℃；加热超声法采用甲醇-水（98∶2）为流动相，检测波长为325nm，色谱柱温度为40℃。 结果 通过检测，两种方法所得出的含量相差较小，相对误差均在1.0%之内。 结论 两种测定方法均科学有效，能对汤臣倍健维生素A维生素D软胶囊（儿童型）中维生素A的含量起到质量控制的目的。方法2更为快捷简单，溶剂使用量少，能够节省检验成本，提高人员利用率。

[关键词] 高效液相色谱法；维生素A；方法比较

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）01-103-04

[Abstract] Objective Through the comparison of two different methods for the determination of vitamin A content，provides the reference for the content determination of vitamin A and its preparation，and to establish a rapid，accurate，simple detection method. Methods All by HPLC，using methanol water boiling water bath reflux saponification method （94：6） as mobile phase，the detection wavelength was 300nm，column temperature was 40℃；using methanol water heating and ultrasonic method （98：2） as mobile phase，the detection wavelength was 325nm，column temperature was 40℃. Results By detecting the content of two kinds of methods，the less difference，relative error is within 1%. Conclusion Two analysis methods are scientific and effective，vitamin A vitamin D soft capsules（for children） content of vitamin A to the purpose of quality control. Methods 2 is more simple，less solvent consumption，can save the test cost，improve the utilization rate.

[Key words] HPLC；Vitamin A；Comparison of methods

维生素A（图1）可促进视觉细胞内感光色素的形成，调试眼睛适应外界光线强弱的能力，以降低夜盲症和视力减退的发生，维持正常的视觉反应。而维生素A摄入过量也会引起副作用，可损害脑组织等，因此维生素A制剂含量的控制十分重要[1-3]。由于维生素A的不稳定性，放置不当或放置时间过长均易导致其变质，故选择一种快捷简单、结果可靠、专属性强、灵敏度高、成本低廉的测定方法，显得尤为重要[4-5]。

维生素A在分类中属于脂溶性维生素，能够调节人体的多种生理机能，增强机体免疫能力，在调节体内各方面的代谢及促进骨骼的生长发育上有着极其重要的作用，同时它也参与视网膜视紫质的合成与再生，维持正常视觉[6-7]。维生素A主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又叫视黄醇。为黄至带红色的橙黄色液体，冷冻后可固化，有异臭，耐光和耐氧性弱，易被脂肪氧化酶分解[8-9]。不溶于水和甘油，混溶于氯仿、乙醚和脂肪。

1 仪器、对照品与试剂

维生素A醋酸酯对照品（DR，30112，纯度：98.8%）；维生素A视黄醇对照品（SIGMA，BCBG2044V，纯度：98%）；甲醇（AR级）；95%乙醇（AR级）；乙醚（AR级）；氢氧化钾（AR级）；抗坏血酸（AR级）；甲醇（HPLC级）；蒸馏水。

超声波清洗器（EQ-500）；高效液相色谱仪（岛津-15C）；TB-215D型电子分析天平；AL-204型电子分析天平；EMS-50型磁力搅拌水浴锅；R-202旋转蒸发器。

2 结果

2.1 方法1

色谱条件：色谱柱：CNW Athena C18-WP（5μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（94：6）为流动相；流速为1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长为300nm。

对照品溶液的制备：精密称取维生素A对照品5.67mg至50mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至50mL，摇匀即得，作为标准储备母液。精密称取芘内标物32.18mg至500mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至刻度，摇匀即得内标溶液。精密量取1mL维生素A视黄醇对照品储备母液至50mL容量瓶，加95%乙醇溶解并定容，以95%乙醇为空白，在325nm波长处测定其吸光度。按C=A/1835÷100×1 000 000计算，其中C是浓度（单位为μg/mL），A是平均吸光度，1835是吸光系数，100是%系数转换因子，1 000 000是单位转换系数。精密吸取对照品溶液0.5、1、2、3、5mL置于25mL容量瓶中，精密加入内标溶液3mL，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得5个不同浓度的对照品溶液，浓度为2.00272μg/mL，4.00544μg/mL，8.01088μg/mL，12.01632μg/mL，20.02720μg/mL。

供试品溶液的制备 取3个不同批号的汤臣倍健维生素A维生素D软胶囊（儿童型），分别编号为1、2、3。各取20粒样品，挤出内容物，搅拌均匀后精密称取试样约0.075g于250mL三角瓶中，用95%乙醇约50mL使其溶解，直到颗粒物分散均匀为止。加入10%抗坏血酸水溶液5mL、3mL芘内标液、10mL氢氧化钾水溶液（1∶1），混匀。于沸水浴回流60min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。用50mL的水分两次将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL乙醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上在（50±2）℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣精密加入95%乙醇25mL，超声波提取溶解，过滤，即得。

2.1.1 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.1.2 标准曲线 按上述色谱条件测定。

2.2 方法2

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ACCHROM Unitary C18（2.8μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（98：2）为流动相；流速为1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长为325nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 称取维生素A醋酸酯对照品5.51mg到50mL容量瓶中，加适量甲醇，超声使其溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为标准储备母液。精确量取5mL标准储备母液到50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm的滤膜，即得。

2.2.3供试品溶液的制备 分别取编号为1、2、3的样品，挤出内容物，搅拌均匀后精密称取试样约0.55g置于25mL容量瓶中，加甲醇适量，于50～55℃超声，并不时振摇样品，30min后取出，冷却，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，过0.45μm的滤膜，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液2μL、5μL、10μL、25μL、40μL与供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.5 标准曲线 按上述色谱条件测定，所测峰面积见表3。

经检测，两种方法得出的含量均在规定范围之内（50.00～83.25mg/100g），方法1为国家标准GB/T 5009.82-2003所使用的方法，通过验证两种不同的检验方法，所测出的维生素A的含量相差较小，相对误差均在1.0%之内，证明两种测定方法均科学有效，能对汤臣倍健维生素A维生素D软胶囊（儿童型）中维生素A的含量起到质量控制的目的。而方法2的对照品配制方法、样品处理方法更为快捷简单，耗用时间短，溶剂使用量少，能够节省检验成本，提高人员利用率，更为适合本企业。

3 讨论

由于维生素A性质不稳定，分析时间长会造成维生素A分解，故应尽量缩短分析时间。经过紫外光谱测定，在该色谱条件下，维生素A在325nm波长处有最大吸收，因此方法2中选择325nm作为检测波长；流动相中甲醇与水的比例经过试验，当比例为（94∶6）时样品中维生素A与内标物的分离较好，且维生素A保留时间适中，故方法1选用该比例进行测定；在方法1中，当使用乙醚进行萃取后静置，有部分样品会出现乳化现象。当出现该现象时，往分液漏斗中加入适量纯化水或者95%乙醇，即可消除该现象。

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（收稿日期：2014-10-21）