金叶女贞果实中齐墩果酸的提取与测定

王建安，王慧云，李艳芝，刘玉凤，杨 涛

（济宁医学院药学院，山东日照276826）

金叶女贞果实中齐墩果酸的提取与测定

王建安，王慧云*，李艳芝，刘玉凤，杨 涛

（济宁医学院药学院，山东日照276826）

目的：以金叶女贞果实为原料，优化超声提取其中齐墩果酸的最佳工艺。方法：以齐墩果酸含量为考察指标，在单因素实验基础上，采用L9（34）正交设计实验，以乙醇浓度、超声时间、超声功率、料液比4因素进行正交实验，优化超声波提取金叶女贞果实中齐墩果酸的工艺，并采用紫外分光光度法测定其含量。结果：在实验影响因素中，影响程度从大到小依次为超声功率＞超声时间＞乙醇浓度＞粒度；最佳提取工艺为乙醇浓度50%，超声时间80min，超声功率400W，粒度40目，连续提取两次，此时齐墩果酸得率最高，并确定最佳采收时期为秋季。结论：采用此工艺提取方法快速、简单，可以为进一步研究金叶女贞提供参考。

金叶女贞，齐墩果酸，超声波，分光光度法，提取工艺

金叶女贞（Ligustrum Lucidum cv.）为木犀科女贞属常绿小灌木，是由加州金边女贞与欧洲女贞杂交育成的［1］，目前尚无其化学成分及药用价值报道。其同属植物女贞（Ligustrum Lucidum Ait.）的干燥成熟果实女贞子为常用中药［2-3］，其主要成分为齐墩果酸（OA）。OA为五环三萜类化合物，为白色针状结晶，无味，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、丙酮等有机溶剂［4］，其结构复杂，人工合成困难，因此国内外均从植物中提取。齐墩果酸主要具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用，还具有降血糖、降血脂、镇静的作用［5］，是开发治疗肝病和降血糖等药物的有效成分，目前临床上齐墩果酸片等抗肝炎药即是以此研制的。并且由于其广泛的生物学活性，欧美国家现已将其作为天然抗氧化剂应用到食品中［6］。目前齐墩果酸主要从木犀科植物齐墩果（OLea europaea L.）的叶、女贞（Ligustrum Lucidum Ait.）果 实 及 连 翘［Forsythia suspensa（Thunb.）VahL.］的果实等提取获得。但未见有对金叶女贞中提取此类物质的报道。为进一步研究和开发利用新的药用植物资源，本文首次通过超声波辅助法从金叶女贞果实中提取其中齐墩果酸，在单因素实验的基础上研究了超声提取过程中相关条件对齐墩果酸提取率的影响，为优化金叶女贞中齐墩果酸的提取工艺进行了探索，旨在建立一种快速、简便、有效的提取方法，为今后该产品的进一步研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材 采集于济宁医学院日照校区院内，经鉴定为木犀科女贞属植物金叶女贞的果实，去除果柄等杂物后，60℃烘干备用；浓硫酸、冰醋酸、石油醚、无水乙醇、甲醇、香兰素等 均为分析纯；齐墩果酸标准品 购自中国药品生物制品鉴定所（编号110709-200505）。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，KQ-500DB型数控超声波清洗器，LD-02型高速中药粉碎机，电子分析天平，Q-4110石英狭缝比色皿等。

1.2 实验方法

1.2.1 齐墩果酸含量的测定

1.2.1.1 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品5.07mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即每 1mL中含齐墩果酸0.507mg，摇匀即得。

1.2.1.2 检测波长的选择 按照王立业方法［7］，略作改进，取齐墩果酸对照品溶液0.8mL置于25mL具塞试管中，挥干，加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，再加入5mL 60%H2SO4，60℃水浴反应20min，取出后立即用冷水冷却10min以终止反应，以不加对照品的溶液做空白，在200～700nm波长范围内进行紫外全波长扫描，发现最大吸收波长在532nm处。

1.2.1.3 标准曲线的绘制［8］分别精密量取标准溶液0.0（空白对照）、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL（相当于浓度0.0000、0.3042、0.4056、0.5070、0.6084、0.7098、0.8112mg·mL-1）置于具塞试管中。按1.2.1.2项下方法处理，应用UV-win5.0软件测定各溶液的吸光度。以浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线（结果见图1），得齐墩果酸标准溶液浓度X与吸光度值Y关系曲线的回归方程式：Y= 1.0041X+0.2990，R2=0.9991。

图1 齐墩果酸标准曲线

1.2.1.4 精密度实验 取5份供试液各0.2mL，按

1.2.1.2 项下法处理，在532nm处测定其吸光值，计算齐墩果酸含量，得RSD=0.02138%（n=6），表明本法精密度良好，仪器稳定性较好。

1.2.1.5 稳定性实验 取5份供试液各0.2mL，按

1.2.1.2 项下法处理，在12h内每1h测量一次，计算齐墩果酸含量，计算结果为RSD=0.8%（n=14），表明供试品液在12h内稳定性良好，也可说明齐墩果酸在12h内较稳定，显色较好。

1.2.1.6 重现性实验 取5份供试液各0.2mL，按

1.2.1.2 项下法处理，在532nm处测定其吸光值，计算齐墩果酸含量，结果RSD=0.4%。

1.2.1.7 加样回收实验 精密称取已测定的样品粉末2.5g，共6份，采用加样回收率法，加已知含量的齐墩果酸对照品适量依法测定，计算回收率。结果齐墩果酸平均回收率为99.26%，RSD=0.6%（n=6）。

1.2.1.8 齐墩果酸得率计算 公式如下：

式中，C：测定液齐墩果酸质量浓度，mg·mL-1；W：称取药材量，g；V：提取溶液体积，mL。

1.2.2 金叶女贞果实中齐墩果酸的提取工艺的优选

为系统考察超声法提取金叶女贞果实中齐墩果酸的工艺参数，根据多次单因素实验的结果，拟选用乙醇浓度（A）、提取时间（B）、超声功率（C）、粒度（D）作为考察因素，以样品中齐墩果酸含量为考察指标，采用4因素3水平正交表，即L9（34）正交表进行实验，各因素及水平设置如表1所示。

表1 因素水平表L9（34）

准确称取干燥至恒重的药材5.00g，按L9（34）正交设计的方案下进行3次重复实验。每次加入相应浓度的乙醇75mL，超声提取2次，合并提取液，50℃减压浓缩至干，用石油醚萃取2次，过滤蒸干，用甲醇定容至10mL，取1mL置于具塞试管中，挥干，然后按1.2.1.2项下方法测定吸光度值，带入齐墩果酸标准曲线方程得出质量浓度，然后计算各提取液中齐墩果酸的得率。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果

根据对实验结果进行极差分析（表2）可以看出影响金叶女贞果实得率的因素依次为：超声频率（C）＞提取时间（B）＞乙醇浓度（A）＞粒度（D），最佳组合为A1B3C2D3，即粒度为40目，乙醇浓度为50%，超声时间为80min，超声功率300W，连续提取2次，在此条件下齐墩果酸得率最高，含量达到1.2409mg·g-1。

表2 正交实验结果

经方差分析表明（见表3），超声功率与超声时间对齐墩果酸提取率具有显著的影响（P＜0.05），而粒度与乙醇浓度则均未达到显著水平（P＞0.05）。

表3 正交实验方差分析表

2.2 验证性实验

按照选定的最佳提取方案进行三次平行实验，结果其平均得率为0.98%，高于正交实验中任何一组的得率，证明所选工艺可行。

2.3 不同采收时期齐墩果酸含量的比较

分别对秋季及春节后采收的两批材料进行实验，实验结果表明，秋季采收的含量为1.19mg·g-1，而春节后采收的含量为0.98mg·g-1，这表明今后在选择采收时应以秋季采收为宜。

3 结论

本文在多次单因素实验基础上进行了多因素正交实验，研究了超声波法辅助提取金叶女贞中齐墩果酸的最佳工艺。超声波通过超声化作用产生强烈振动、空化效应及搅拌作用，使局部升温和局部高压，破坏植物组织结构，产生局部粉碎作用，强化提取过程，具有提取速度快、得率和纯度较高的优点［9-10］。

从正交实验的直观分析和方差分析可知，影响因素的主次顺序为超声频率＞提取时间＞乙醇浓度＞粒度。并确定最佳工艺为乙醇浓度50%，超声时间80min，超声功率300W，粒度40目，连续提取两次，此时得率达到最高；另外，由实验结果得知最佳采收时间为秋季，这也与大多数果实类药材的采收时间相一致，为今后从植物资源中提取齐墩果酸提供了新的思路。

齐墩果酸分析方法目前主要采用高效液相色谱法（HPLC）［11］、薄层色谱法（TLC）［12］、气相色谱法（GC）［13］及毛细管电泳（CE）［14］等方法，其中TLC法的实验条件最容易达到，但结果的重现性较差；GC法因需要衍生化，故操作复杂，回收率也不高；HPLC法的测定条件最为成熟，但设备相对较为昂贵。本实验采用紫外分光光度法进行测定，从实验结果表明，本法操作简便，测定结果准确、快速，具有良好的重现性，且所需设备、试剂低廉易得，今后可作为该类物质及其制剂的的质量控制方法。

化学成分含量的差别与生长的环境关系密切，拟在今后收集不同产地的金叶女贞果实进行含量的比较，并进一步进行药理学实验，为今后的开发提供有力的理论依据。

［1］孙晓萍.金叶女贞的引种栽培和园林价值［J］.浙江林学院学报，1995，12（2）：156-160.

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Extractiion and determinnation of oleanolic acid from Ligustrum Lucidum cv.

WANG Jian-an，WANG Hui-yun*，LI Yan-zhi，LIU Yu-feng，YANG Tao
（SchooL of PharmaceuticaL Science，Jining Medical University，Rizhao 276826，China）

Objective：To optimize extraction condition of oleanolic acid from the fruit of Ligustrum Lucidum cv.by ultrasound wave.Methods：With oleanolic acid as index，based on single factor test，using L（934）orthogonal test，the effects of ethanol concentration，partical sizes，ultrasonic power and extracting time were considered.The contents of oleanclic acid were determined by UV-spectrophotometry.Results：The order of factors to affect the oleanolic acid extraction would activate by ultrasonic power，extraction time，ethanol oncentration，partical sizes.The optimum ultrasonic extractions were as follows：50%ethanol solution as extraction solvent，ultrasonic power 300W，extraction time 80min and treating with ultrasonic for twice repeatedly，the contents of oleanolic acid was the highest.And the best harvest time was autumn.Conclusion：The optimized technology is quick and simple，and can be used as theoretical basic of Ligustrum Lucidum cv.

Ligustrum Lucidum cv.；oleanolic acid；ultrasonic wave；spectrophotometric methods；extracting technics

TS255.1

B

1002-0306（2010）11-0301-03

2009-11-11 *通讯联系人

王建安（1972-），男，硕士，讲师，主要从事药用植物资源与活性成分研究。