向日葵黄色素抗氧化活性及清除自由基活性能力的初探

丛建民，陈凤清，江海龙，刘 艳，沈海龙，*

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.白城师范学院，吉林白城137000）

向日葵黄色素抗氧化活性及清除自由基活性能力的初探

丛建民1，2，陈凤清2，江海龙2，刘 艳1，沈海龙1，*

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.白城师范学院，吉林白城137000）

本文从向日葵花中提取黄色素，研究其抗氧化活性。结果表明，向日葵黄色素对DPPH、超氧阴离子自由基（·）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）都具有较强清除作用，并且随加入量的增加而增大。说明向日葵花黄色素是一种很有开发前景的抗氧化剂，具有很高的利用价值。

向日葵花黄色素，DPPH，超氧阴离子自由基，羟自由基，过氧化氢，抗氧化

在生物机体的生命活动中，新陈代谢过程中不断发生着氧化和还原反应，氧化代谢会不断产生各种自由基。自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性。体内自由基和脂质过氧化作用使各种大分子成分如核酸、蛋白质发生氧化变性，DNA交联和断裂，导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老及心血管等疾病［1］。食品的色泽是衡量食品质量的主要指标之一，在食品中添加色素，不但能保证产品色泽均匀性，而且还能改进产品的外观。天然色素在食品上的应用成了近年来新兴的科学研究领域［2-5］。从农作物和果蔬中提取的天然色素，其色泽自然、安全、无毒副作用，具有较高的营养。植物色素中存在多种生物活性物质如花色苷类、多酚类、黄酮类等，具有清除自由基等抗氧化活性，这些功能对抗癌、防癌、抗衰老、预防心血管疾病、提高身体健康有促进作用［6］。本文从向日葵花瓣中提取的黄色素含有黄酮类物质和类胡萝卜素类物质，而这二类物质均具有良好的抗氧化活性功能，而且均是通过清除自由基达到抗氧化效果的。因此为了考察向日葵花黄色素的功能特性，采用FRAP法和DPPH法、邻苯三酚自氧化法、邻二氮菲-Fe2+氧化法、鲁米诺化学发光法初步探讨向日葵花黄色素的抗氧活性及清除自由基能力，为开发向日葵花黄色素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

向日葵花瓣 2007年8月采摘于白城师范学院校园内，阴干，粉碎后过40目筛，样品作为实验样品。按料液比1∶40（g/mL）加入70%（v/v）的乙醇溶液中，50℃恒温浸提3h后离心，上清液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，浓缩液冻干后得粉末；FeCl3、FeSO4、HCl、VC、H2O2、苯甲酸、醋酸、醋酸钠、无水乙醇、95%乙醇、罗丹明B、三羟甲基氨基甲烷、二丁基羟基甲苯（BHT） 均为国产分析纯试剂；鲁米诺、邻苯三酚、三吡啶三亚吖嗪、tripyridyltriazine（TPTZ）、l，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） Sigma公司。

RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津；BS200s电子分析天平，UV-1700紫外-可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 色素总抗氧化能力的测定 采用FRAP法［7-8］。

Fe3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被试样中还原物质还原为Fe2+形式，呈现出明显的蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。

测定方法：分别配制0.10g/L的各种色素以及VC溶液作为样品，按0.1mL样品+0.3mL水+3mL FRAP工作液比例混合，摇匀后37℃下加热4min，于593nm测其吸光值；另以 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L FeSO4的标准溶液代替样品做标准曲线，计算出直线回归方程，进而计算出样品的总抗氧化能力，以毫摩尔 FeSO4/g提取物表示，单位为mmol/g。

FRAP工作液为 10mmol/LTPTZ+20mmol/L FeCl3+0.3mmol/L醋酸钠缓冲液 1∶1∶10的混合物。

1.2.2 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收波长为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时［9-12］，溶液颜色变浅，A517nm值变小，而且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，因此可用自由基的清除情况来评价某物质的抗氧化能力，其抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强。

先用无水乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH溶液，同时分别称取一定量的各种固体色素及VC用蒸馏水溶解，并将其稀释为以下浓度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/L，作为测定液。取测定液2mL及DPPH溶液2mL加入同一具塞试管中，摇匀，30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度Ai，同时测定2mL DPPH溶液与2mL无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2mL测定液与2mL无水乙醇混合液的吸光度Aj，根据下式计算测定液对DPPH的清除率。按以上测定方法分别测定其清除率，得出直线回归方程，进而计算其50%清除率（IC50）。

式中：Ac为未加测定液时DPPH的吸光度；Aj为测定液在测定波长吸光度；Ai为加测定液后DPPH的吸光度。

分别配置不同浓度的色素样品，以VC为参照，按上述方法测定不同浓度的样品对超氧阴离子自由基（·）的清除率。

1.2.4 羟自由基（·OH）的清除能力的测定 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法［14］：在试管中依次加入5mmol/L邻二氮菲0.6mL，pH7.4的磷酸盐缓冲液0.4mL和5mmol/L Fe2+-EDTA（体积比为1∶1.5）0.6mL；其中加入体积分数为0.1%H2O20.8mL作为损伤管，加入体积分数为0.1%H2O20.8mL和lmL样品的作为样品管，不加H2O2和样品的作为空白管；将各管用无水乙醇定容到4mL，37℃下反应1h，536nm波长下比色。按下公式计算清除率：

分别配制不同浓度的色素样品，以VC为参照，按上述方法测定不同浓度的样品对轻自由基（·OH）的清除率。

1.2.5 过氧化氢（H2O2）清除能力测定 采用鲁米诺化学发光法［15］：向反应池中加入50μL供试液，50μL 1mmol/L鲁米诺溶液，放入反应池中。100μL pH9.5碳酸缓冲液，摇匀后加体积分数0.15%H2O250μL，启动发光反应，连续测定反应强度6s，至出现峰值，记录发光强度（C1），绘制清除率与样品浓度曲线。

2 结果与分析

2.1 向日葵花黄色素、VC、BHT的抗氧化活性比较

表2采用FRAP法测定结果表明，向日葵黄色素具有一定的抗氧化活性，其总的抗氧化活性相当于食品中常用的抗氧化剂BHT的总抗氧化活性45%以上，相当于VC总抗氧化活性的52%以上。

表1 各样品的测定结果（±s，n=5）

表1 各样品的测定结果（±s，n=5）

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表2 向日葵花黄色素、VC、BHT的抗氧化活性比较（mmol/100mg）

2.2 向日葵花黄色素对DPPH·的清除效果

图1 向日葵黄色素、VC对DPPH·的清除效果

由图1可见，向日葵黄色素与VC对DPPH·的清除效果均随其质量浓度的增大而增大，当浓度高于0.5mg/mL时，浓度的改变对其清除率的影响较小，在低浓度时，色素与VC的效果相当，在0.2mg/mL以上浓度，色素的清除效果高于VC。

2.3 向日葵花黄色素对超氧阴离子的清除效果

从图2数据分析可知，向日葵黄色素和对照物VC对超氧阴离子自由基（·）有极强的清除作用，且清除能力与浓度有明显的量效关系。从图中可以看出，同为0.1mg/mL的向日葵花黄色素对超氧阴离子自由基（·）的清除作用明显优于等浓度的VC。

图2 向日葵黄色素、VC对超氧阴离子自由基（·）的清除效果

2.4 向日葵花黄色素对羟自由基（·OH）清除效果

向日葵花黄色素和VC对羟自由基（·OH）清除率的测定结果见图3。由数据可知，向日葵黄色素对羟自由基（·OH）表现出显著的清除效果，其清除能力强于VC，且随着色素浓度的升高，清除率也随之增加，量效显著。

图3 向日葵黄色素、VC对羟自由基（·OH）的清除效果

2.5 向日葵花黄色素对H2O2的清除效果

由图4可见，对照物VC与向日葵黄色素的清除率均随质量浓度的增加明显增大，说明向日葵黄色素具有清除H2O2的作用，与VC的清除效果相当。

图4 向日葵黄色素、VC对H2O2的清除效果

3 结论

向日葵花黄色素具有抗氧化活性，同时对DPPH·、超氧阴离子自由基（·）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）都具有较强清除作用，并且随加入量的增加而增大。同时说明向日葵花黄色素是一种很有开发前景的抗氧化剂，具有很高的利用价值，既可以用作食品着色添加剂开发，也可以用于天然药物的研制，有关其在人体内的抗氧化作用及其色素中的花色苷、黄酮等的种类、含量、结构等有待于进一步研究。

［1］Rice Evans G，Miller NJ.The relative anthioxidant activities of plant derivedploy phenboic flavonoids［J］.Free Radical Res，1995，22：375-383.

［2］田萍，周三，倪睿，等.野生大豆黑色种皮色素提取物抗氧化活性研究［J］.食品研究与开发，2008（12）：178-180.

［3］吕晓玲，刘楠.黑胡萝卜色素精制工艺及其体外抗氧化性的研究［J］.食品研究与开发，2008（12）：174-178.

［4］许青.类胡萝卜素研究进展［J］.国外医学生理、病理科学与临床分册，1996（4）：249-250.

［5］裴凌鹏，惠伯棣.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展［J］.食品科学，2004（2）：203-207.

［6］Alison D，Paul C.Nature Pigment［J］.International Journal of Food Science and Technology，2000（35）：5-22.

［7］Benzie IFF，Strain JJ.The ferric reducing ability of plasma as a measure of“antioxidant power”：the FRAP assay［J］.Anal Biochem，1996，239：70-76.

［8］Larrauri JA，Sanchez Moreno C，et al.Effect of temperature on the free radical Scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels［J］.J Agric Food Chem，1998，7：2694 -2697.

［9］Nicole C，Jean-Luc B，Jean-Pierre C，et al.Antioxidant properties of hydmxy-flavones［J］.Free Radical Biology and Medicine，1996，20（1）：35.

［10］Alexandre C，K urt H，Wahio D，et al.Antioxidant and lipophilic constituents of tinosporacrispa［J］.Planta Medica，1998，64：393.

［11］Begoa Bartolom，Vernica Nuez.In vitro antioxidant activity of grape skin［J］.Eur Food Res Technol，2004，218：173-177.

［12］Liang li，Lucy Yu，Ke quan，et al.Antioxidant properties of cold pressed black caraway，carrot，cranberry and hemp seed oils［J］.Food Chemistry，2005，91：723-729.

［13］刘慧燕，赵谋明.江篱低分子量多糖的提取以及抗氧化活性研究［J］.食品工业科技，2005，25（3）：67-69.

［14］金鸣，蔡亚欣.邻菲-Fe2+氧化法检测Fe2+/H2O2产生的羟自由基［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.

［15］盂庆国.薤白水提物对羟自由基的清除作用［J］.潍坊医学院学报，1998，20（1）：33-34.

Study on Helianthus yellow pigment antioxidant activity and free radical scavenging capacity

CONG Jian-min1，2，CHEN Feng-qing2，JIANG Hai-long2，LIU Yan1，SHEN Hai-long1，*
（1.Northeast Forestry University，Haerbin 150040，China；2.Baicheng Normal College，Baicheng 137000，China）

Antioxidant activity of Helianthus yellow pigment extract was studied.The results showed that the Helianthus yellow pigment had strong scavenging effect to DPPH，superoxide anion（·），hydroxyl radical（·OH）and hydrogen peroxide（H2O2），the scavenging effect increased according to the increase of adding amount.Helianthus yellow pigment has high value with promising development prospects.

Helianthusyellow pigment；DPPH；superoxide anion；hydroxylradical；hydrogen peroxide；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0315-03

2009-07-02

丛建民（1974-），讲师，主要从事生物化学、分子生物学研究工作。

吉林省中医药管理局资助项目（ZY31）；白城市科技局资助项目（20070403）。