响应面法优化RHIZOPUS MICROSPORUS VAR.CHINENSIS产生淀粉酶的条件

李彧娜，石贵阳，王 武，*，王正祥，*

（1.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心，江苏无锡214122）

响应面法优化RHIZOPUS MICROSPORUS VAR.CHINENSIS产生淀粉酶的条件

李彧娜1，2，石贵阳1，2，王 武1，2，*，王正祥1，2，*

（1.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心，江苏无锡214122）

对Rhizopus microsporus var.chinensis固态发酵产生淀粉酶的条件进行了优化。首先采用单因子实验确定最适固态发酵基质为小麦麸皮，最适碳源和氮源分别为可溶性淀粉和硫酸铵，通过控制培养基初始pH为3.0、初始湿度为70%时，使其生淀粉酶产量提高3.5倍。在此基础上，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，得出每500mL三角摇瓶中含小麦麸皮13.7g、可溶性淀粉0.063g、硫酸铵0.052g时，生淀粉酶产量达到48.50U/mL，比初始产量提高了8倍。

生淀粉酶，响应面优化，Rhizopus microsporus var.chinensis

生淀粉酶是能够直接水解不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒的一类酶。目前还没有一个严格的生淀粉酶的界定范围，一般来说，凡是可以直接作用、水解或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶都可称为生淀粉酶［1］。生淀粉酶可以将传统淀粉制糖工艺中的淀粉糊化、液化、糖化合并为一步进行，从而有效缩减生产成本［2］。目前报道的生淀粉酶作用温度一般在30～40℃，而在淀粉水解过程中适当提高水解温度既可以防止杂菌污染，又能提高水解速率［3］。本研究室在前期工作中分离到一株能够产生葡萄糖淀粉酶的Rhizopus microsporus var.chinensis菌株。该菌产生的生淀粉酶具有一定耐热性能和较宽的作用pH范围，有一定的工业应用前景。本文先通过单次单因子法，找出了该菌株固态发酵培养基中的三个最主要的影响因素［4］，在此基础上通过响应面法对上述三个因子水平及其交互作用进行优化与评价，快速有效地确定了多因子系统的最佳条件［5］，确定了该菌株产生淀粉酶的最佳发酵培养基配方和发酵参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所用菌种 分离自贵州遵义百年磨坊的磨盘下泥土，经鉴定并保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心。

UV2100紫外可见分光光度计 美国UNICO公司；1-15高速冷冻离心机 德国 SIGMA公司；HB-100恒温金属浴 杭州博日科技有限公司；HYG-A全温摇床柜 太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活力测定 底物为玉米淀粉颗粒悬浮液，用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制。在5mL离心管中分别加入1mL底物、0.1mL酶液，在50℃恒温振荡（150r/min）反应1h后，加入2mol/L NaOH溶液0.05mL终止反应，将反应液5000r/min离心5min，取上清液测定还原糖的含量。酶活力定义为：在以上分析条件下1min释放1μmol还原糖所需酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 单次单因子法设计［4］影响发酵培养的因素很多，本实验主要考察固体基质（稻壳、玉米粉、小麦麸皮、小麦粉和大麦粉），初始发酵培养基湿度（50%～100%），初始培养基pH（3.0～8.0），用0.1mol/L的HCl或NaOH调节；氮源（无机氮源：硫酸铵、氯化铵、硝酸铵，有机氮源：豆饼粉、尿素、蛋白胨），碳源及产酶诱导物（玉米淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉）对发酵产酶的影响，采用单因素水平对照实验选出最佳固体基质、初始培养基pH、湿度、氮源和碳源，作为响应面法研究的基础条件。

1.2.2.2 响应面法设计［5］根据单次单因子法实验所确定的影响水平，按照中心复合设计原理设计，并利用SAS 8.0软件包安排实验。设计三因素、三水平的实验，因素水平如表1所示。

表1 发酵培养基因素水平表

2 结果与讨论

2.1 利用单次因子法确定发酵主要参数

2.1.1 发酵基质的影响 对于丝状真菌而言，固态发酵方式往往比液态发酵方式更不易染菌，酶产量更高。在固态发酵过程中，发酵基质的选择是一个关键的因素。本研究中选择了五种固体基质，依次为：稻壳、玉米粉、小麦麸皮、小麦粉和大麦粉，实验结果见图1。五种基质都能够作为发酵产酶的良好基质，其中小麦麸皮以12.0±0.81U/mL的产酶效果为最佳。小麦粉（10.2±0.79U/mL）和玉米粉（7.5± 0.71U/mL）也是较好的基质，但产酶量略低于小麦麸皮。稻壳（6.0±0.72U/mL）和大麦粉（6.8±0.73U/mL）的产酶效果较差。

图1 培养基中添加不同发酵基质对产酶的影响

2.1.2 初始发酵培养基湿度的影响 初始发酵培养基湿度分别选择50%～100%，对于固态发酵而言，增加或是减少发酵培养基的湿度都会显著影响产酶［6］。较高的湿度会导致供氧困难，从而影响气生菌丝的形成，而较低的湿度会降低营养物质在培养基中的溶解度，从而减少营养物质的吸收。实验发现当初始发酵培养基湿度为 70%时，产酶量最高为14.1±1.1U/mL（图2）。

图2 初始发酵培养基湿度对产酶的影响

2.1.3 初始发酵培养基pH的影响 由于固态发酵培养基有更好的缓冲能力，丝状真菌在固态发酵时能够在较宽的 pH范围内生长［7］。本文中菌株Rhizopus microsporus var.chinensis在pH3.0～8.0之间时均能产酶，当pH为3.0时，产酶量最高（图3）。

图3 培养基初始pH对产酶的影响

2.1.4 不同氮源对产酶的影响 考察了几种不同的无机和有机氮源对发酵产酶的影响。其中各种有机氮源（包括豆饼粉、尿素和蛋白胨）对产酶的影响不大，产酶量均在16U/mL左右；而无机氮源中的硫酸铵、氯化铵和硝酸铵均能有效促进产酶，在添加0.2%硫酸铵的情况下，产酶量可达18.2±1.3U/mL。这与Ray等［8］报道的在培养基中添加无机铵盐能显著增加Rhizopus oryzae酶产量的结果相一致。本研究还发现，持续增加氮源的量并不能使酶产量进一步增高（图4）。

图4 培养基中添加不同氮源对产酶的影响

2.1.5 不同碳源对产酶的影响 淀粉不仅可作为菌株生产的碳源，还可作为产生淀粉酶的诱导物，因此，本文选择了三种淀粉作为考察对象。作为改性淀粉的一种，可溶性淀粉（20.1±1.2U/mL）比玉米淀粉（18.3±1.1U/mL）和土豆淀粉（18.0±1.2U/mL）更易于被菌株降解和利用，为最佳碳源和诱导物（图5）。

［1］诸葛斌，姚惠源，姚卫蓉.生淀粉糖化酶的结构和作用机理［J］.工业微生物，2001，31（4）：49-51.

［2］董永存，刘洋，陈源源，等.嗜热菌来源的生淀粉酶分离纯化及其酶学性质［J］.微生物学报，2008，48（2）：169-175.

［3］van der Maarel MJEC，van der Veen B，Uitdehaag JCM，et al.Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family［J］.Journal of Biotechnology，2002，94：137-155.

［4］杨德.实验设计与分析［M］.北京：中国农业出版社，2002：112-120.

［5］张润楚，邓海涛，兰燕，等译.实验设计与分析及参数优化［M］.北京，中国统计出版社，2003：346-350.

［6］Hesseltine CW.Solid state fermentations［J］.Biotechnology and Bioengineering，1972（14）：517-532.

［7］Annunziato ME，Mahoney RR，Mudgett RE.Production of α-galactosidase from Aspergilus oryzae grown in solid state culture［J］.Journal of Food Science，2006（51）：1370-1371.

［8］Ray RC.Extracellular amylase（s）production by fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae grown on cassava starch residue［J］.Journal of Environmental Biology，2004（25）：489-495.

图5 培养基中添加不同碳源对产酶的影响

经过单次因子实验优化，确定小麦麸皮为固体基质，添加0.2%硫酸铵和0.02%可溶性淀粉并调节初始发酵培养基pH至5.0，初始发酵培养基湿度为70%时，产酶量达21.2U/mL，比优化前提高了3.5倍。

2.2 利用响应面法设计确定培养基组成

通过单次因子实验确定了三个主要的影响因素后，采用响应面分析法来分析三个因素间的相互关系。表2列出了实验设计的组合和实验结果。

表2 响应面实验设计及结果

拟合线性回归方程为：R1=47.04-0.84A-1.84B -3.41C+2.10AB-2.52AC+1.16BC-10.34A2-2.89B2-8.77C2

R1为酶活力，该模型高度显著（p＜0.0001），相关系数R2=0.97，能对实验数据进行较好的拟合。

由表3可知，变量的因子分析表明可溶性淀粉和硫酸铵的含量均为影响产酶水平的重要因素。上述两个变量对产酶水平的影响见图6。

表3 方差分析

本文选用两步法优化了固态发酵培养基的组成和发酵过程参数，提高了 Rhizopus microsporus var. chinensis CICIM F0088的生淀粉酶产量。通过单次因子实验发现，在单次因子选择实验中，小麦麸皮、可溶性淀粉和硫酸铵是影响发酵产酶的主要因素；基于上述结果，针对这三个因素做了三水平的响应面分析实验，实验结果表明，当培养基组成为小麦麸皮13.7g，可溶性淀粉0.063g，硫酸铵0.052g时，产酶的最大值应为47.90U/mL，实际实验中，在发酵60h后，三次平行实验的结果分别为48.50、47.75、48.12U/mL，其产酶水平较优化前提高了8倍，与预测值相符，证实了响应面分析方法在本文中的可靠性与统计学方法的有效性。

图6 可溶性淀粉（B）和硫酸铵（C）对产酶的影响

3 结论

本课题组在前期研究中筛选得到一株有生淀粉水解能力的丝状真菌 Rhizopus microsporus var. chinensis CICIM F0088。该菌株所产生的淀粉酶兼具生淀粉水解能力、较高的耐热性和较宽的pH适用范围，因而有着广阔的工业应用前景。但该菌株是从自然界筛选获得的野生菌株，其产酶水平较低，本文通过单因子筛选和响应面优化结合的方法对其培养基和培养条件进行优化，将其生淀粉酶产量提高8倍，为以后工业应用打下基础。

Optimization of raw starch digesting amylase fermentation condition with Rhizopus microsporus var.chinensis by response surface methodology

LI Yu-na1，2，SHI Gui-yang1，2，WANG Wu1，2，*，WANG Zheng-xiang1，2，*
（1.School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；（2.Research Center of Bio-resource and Bio-energy，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The fermentation condition of raw starch digesting amylase by Rhizopus microsporus var.chinensis was optimized.Using single factorial experiments，sources of solid state substrate，carbon and nitrogen were determined as wheat，soluble starch and ammonium sulfate，respectively.Then raw starch digesting amylase production was increased by 3.5 times in the above medium with initial pH of 3.0 and humidity of 70%.The optimal medium composition for raw starch digesting amylase production was determined by response surface methodology as：13.7g wheat，0.063g soluble starch and 0.052g ammonium sulfate in 500mL flask.The enzyme production was increased to 48.50U/mL，which was 7 times higher than that of the original medium.

raw starch digesting amylase；response surface methodology；Rhizopus microsporus var.chinensis

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0184-03

2009-11-18 *通讯联系人

李彧娜（1981-），女，博士研究生，研究方向：工业微生物学和发酵工程。

国家高技术研究发展计划“863”项目（2006AA020204）。