聚丙烯腈分离膜表面的酶固定化研究进展＊

吴青芸 万灵书 徐志康

(浙江大学高分子科学与工程学系高分子合成与功能构造教育部重点实验室 浙江杭州 310027)

聚丙烯腈分离膜表面的酶固定化研究进展＊

吴青芸 万灵书 徐志康＊＊

(浙江大学高分子科学与工程学系高分子合成与功能构造教育部重点实验室 浙江杭州 310027)

总结了近 30年来围绕聚丙烯腈分离膜表面酶固定化的实现、酶活性的保持及其应用研究等相关问题的进展,并对今后的发展前景予以展望。

酶作为一种生物催化剂,与其他无机或有机催化剂相比,具有催化效率高、专一性强、作用条件温和、反应控制容易等特点,被广泛应用于合成化学、食品工程、环境治理等领域以及生物反应器和生物传感器等高新技术。但是自由酶在实际应用中存在许多局限,如:对温度、pH和无机离子等外界因素的稳定性较差,难于从底物和产物中回收而限制了酶的连续化反应,产物需要进一步分离纯化而增加了生产成本等。为克服这些限制,固定化酶技术应运而生。将酶固定于载体上不仅能有效地解决分离和回收利用的问题,而且对提高酶的稳定性、利用率和使用寿命具有重要意义。目前,用于固定酶的载体有多种,其中分离膜材料表面的酶固定化有机结合了膜的分离作用和酶的生物催化功能,从而受到人们的青睐。自 1968年Michaels[1]首次提出酶-膜生物反应器 (enzyme-membrane bioreactor)的概念以来,酶-膜反应器已被广泛应用于有机相酶催化、手性拆分与合成、生物大分子分解等多个方面。而酶-膜生物传感器的设计和研究更进一步拓宽了固定化酶膜的应用前景。

聚丙烯腈(PAN)具有易成膜、机械强度高、热稳定性好等优点,是较早被用于工业化生产的聚合物分离膜材料之一。此外,丙烯腈单体能与多种烯类单体共聚,其中的腈基也可方便地实施化学反应,这些都为聚丙烯腈膜材料的改性提供了有利的条件。聚丙烯腈分离膜根据其形态可分为平板膜、中空纤维膜和纳米纤维膜。其中,平板膜和中空纤维膜主要采用浸没沉淀相转化法制备,常选用二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等为溶剂。而近年来重新引起关注的静电纺丝被应用于聚丙烯腈纳米纤维膜的制备,拓展了聚丙烯腈分离膜的研究和应用。20世纪 90年代,Godjevargova等人[2]首次报道了聚丙烯腈超滤膜用于葡萄糖氧化酶的固定化,翻开了聚丙烯腈分离膜表面酶固定化研究的新篇章。随后,人们围绕膜表面酶固定化的实现、酶催化活性和稳定性的提高以及固定化酶膜的应用等相关课题展开了深入的探讨。

1 聚丙烯腈分离膜表面酶固定化的实现

物理法是膜表面酶固定化最简单直接的方法,主要包括吸附法、凝胶化法、包埋法等[3]。它们不涉及化学反应,操作方便,固定化过程温和,酶活性回收率高,但酶与载体的结合力较弱,易受外界因素影响而脱落。Shan等[4]发展了一种电化学包埋法,利用葡萄糖氧化酶在电场作用下随电荷跃迁被包埋到丙烯腈-丙烯酸共聚物多孔膜载体中,不仅提高了酶活保留率,同时兼顾了酶与载体的固定化牢固程度。这种新型的葡萄糖氧化酶电极具有高灵敏度、低检测限、良好稳定性等特点,对于研制高性能的生物传感器有着重要的指导意义。

相对于物理固定法,共价结合法和交联法等化学方法具有结合牢固、抗外界干扰能力强、酶不易脱落等特点[5]。聚丙烯腈膜表面固定酶通常采用共价结合法,即利用酶与膜表面的反应基团形成共价键,从而将酶固定化。Godjevargova等[6]利用共价结合法将葡糖糖氧化酶固定在丙烯腈共聚物膜表面,得到了较离子键合法更高的载酶量、酶活性和稳定性。众所周知,酶蛋白主要由氨基酸组成,且带有可形成共价键的多种化学基团,如氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基等。因此,如何将合适的反应基团引入到膜表面,有效地与酶蛋白进行共价结合,是聚丙烯腈膜材料设计中的首要问题。最直接的方法是表面处理法,即选用适当的化学试剂处理聚丙烯腈分离膜,将腈基转化成其他易反应的基团。氢氧化钠 (NaOH)水溶液是常见的处理剂,它可将腈基水解成羧基或氨基等 (图 1)。Li等[7]用乙醇和氯化氢气体活化腈基,实现了脂肪酶在聚丙烯腈纳米纤维膜上的固定化。然而,由于表面处理法所形成的反应基团数量有限,可控性差,而且处理过程容易破坏膜结构,因而该法的推广应用有待商讨。

图1 氢氧化钠(NaOH)和乙二胺(H2N(CH2)2NH2)处理聚丙烯腈生成氨基的过程

共聚合是聚丙烯腈分离膜表面基团设计的有效方法。丙烯腈容易与不同烯类单体共聚,从而引入不同的反应性基团,其共聚物成膜后可用于多种酶的共价固定。表 1列举了近年来文献报道的共聚单体、酶种类、固定化方法以及膜结构类型等相关信息。Godjevargova课题组开展了较为系统的工作[6,8-9],他们以丙烯腈-甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯腈-N-乙烯基咪唑、丙烯腈-甲基丙烯酸甲酯-乙烯基磺酸钠等多种共聚物制成的超滤膜为载体,用于固定葡萄糖氧化酶、尿素酶、过氧化氢酶等,探讨了载酶量、酶活性、稳定性等性能。

在共聚合的基础上,辅以表面处理法,可进一步增加膜表面固定酶的反应基团数,甚至提高膜的亲水性[2],改善传质特性[10]。Godjevargova等[2]比较了羟胺 (HA)、六亚甲基二胺(HMDA)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMA)、二盐酸肼(HDC)等多种化学试剂对丙烯腈共聚物膜改性后的酶固定化效果,发现随着改性膜(除 HDC外)的亲水性和氨基数量增加,酶活性随之提高。此外,他们用 7种不同的化学方法对丙烯腈-甲基丙烯酸甲酯-乙烯基磺酸钠共聚物进行改性[11],并通过化学法将脲酶固定化于改性后的膜表面。实验结果表明用硫酸氢铵改性后膜表面固定化酶的相对活性最高(68%)。

表1 常见丙烯腈共聚物膜及其酶的固定化

2 固定化酶活性的保持

酶活性的保持是固定化酶研究的重点之一。研究发现,尽管固定化后酶的稳定性提高,但酶的活性在多数情况下低于自由酶,这种动力学行为变化与酶结构的改变、位阻效应、分配效应和扩散效应有关[5]。就膜表面的酶固定化而言,膜孔形态和尺寸不仅决定底物分子的扩散速率,而且直接影响到酶的活性中心对底物分子的定位作用,使酶催化作用受到限制;膜的表面性质则关系到酶构象的保持和酶催化作用的发挥;为特殊酶类提供相应的机制可以辅助和加强催化过程的实现。因此,设计合理的膜形态、构建具有良好性质的膜表面、建立外援机制等对固定化酶活性的保持具有十分重要的意义。

2.1 膜形态

在聚丙烯腈分离膜表面的酶固定化研究中,超滤膜是最常用的载体形式(表 1)。然而,由于超滤膜的表面孔隙率低、孔径小,限制了膜表面的载酶量,导致传质阻力增大,而且易对酶与底物分子的结合造成立体障碍。近年来兴起的聚丙烯腈纳米纤维膜可以有效地克服上述不足,它不仅制备简单,更重要的是具有很高的比表面积,可以承载更多酶,而且这种特殊的表面结构有利于酶催化功能的发挥[19]。

作者所在的课题组[12-13,20-24]利用丙烯腈-马来酸共聚物 (PANCMA)优良的成膜、成纤性质,采用静电纺丝法制备其纳米纤维膜,并用于脂肪酶的固定化。研究表明[22],PANCMA纳米纤维膜表面的脂肪酶固定量((21.2±0.71)mg/g)和保留活性 ((37.6±1.8)%),均大于相应的中空纤维膜 ((2.36±0.06)mg/g,(33.9±1.6)%),而且载酶量随纤维直径的减小而增加。粗略比较发现,该两项指标也明显优于 Godjevargova等人[6]在超滤膜表面的酶固定化结果。

2.2 膜表面性质

分离膜表面是酶固定化的主要场所,其表面性质与稳定酶构象、保持酶活性息息相关。一般认为,具有良好生物相容性的表面可以减弱酶蛋白与膜之间的非生物特异性相互作用,并创造更适宜的微环境。研究发现,在膜表面构建良好的仿生微环境,有利于稳定酶的构象和保留酶的活性。将具有良好生物相容性的生物大分子固定在膜表面是实现仿生改性的有效方法,常用的生物大分子有壳聚糖[20,23-25]、磷脂[26-27]、明胶[20-21]等。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的衍生物,来源广、成本低。作为一种天然的多糖,壳聚糖具有不同于其他生物大分子的优良特性,如化学稳定性高、亲和性好、生物毒性小等。尤其是壳聚糖分子中存在大量氨基,可以通过共价结合的方法稳定地固定在聚丙烯腈膜的表面,形成一种良好的酶固定化载体。叶鹏等[20,23-24]较系统地研究了壳聚糖修饰丙烯腈共聚物膜表面的脂肪酶固定化,通过 EDC/NHS活化,将壳聚糖共价结合在丙烯腈-丙烯酸共聚物中空纤维膜表面,然后用戊二醛法固定脂肪酶 (图 2)。研究结果表明,经壳聚糖改性后,膜表面的载酶量(66.5mg/m2)、保留活性(44.5%)和耐热性能等均得到明显提高。用相同的方法分别对丙烯腈-马来酸共聚物纳米纤维膜和中空纤维膜进行改性,得到了类似的结果。Gabrovska等[28]研究了不同壳聚糖改性方法对聚丙烯腈膜表面酶固定化效果的影响,发现化学共价结合法更有利于提高固定化酶的热稳定性。

图2 壳聚糖修饰丙烯腈共聚物膜表面的脂肪酶固定化过程[23]

磷脂是另一种常用的生物分子,将其用于膜表面改性可以消除固定化酶三维构象的改变,同时显著降低疏水相互作用引起的物理吸附[29]。黄小军等[26-27]通过共聚反应将磷脂基团引入聚丙烯腈主链,经静电纺丝制备纳米纤维膜,用于脂肪酶的固定化,结果发现酶活性显著提高。这主要是由于磷脂基团构建了一个亲水、生物相容和稳定的仿生微环境,而且有效地活化了脂肪酶。

明胶是一种无脂肪的蛋白质,是胶原的水解产物。叶鹏等[20]将壳聚糖和明胶用碳二亚胺法分别引入到丙烯腈-马来酸共聚物纳米纤维膜的表面,用戊二醛法将脂肪酶固定于壳聚糖和明胶修饰的膜材料表面,分别研究了壳聚糖和明胶修饰对固定化脂肪酶活性、载酶量、反应动力学参数和稳定性的影响。结果显示,固定化酶的保留活性、载酶量和热稳定性都较高,其中壳聚糖修饰膜为 45.6%、(22.5±0.75)mg/g和 66%,明胶修饰膜为 49.7%、(20.7±0.75)mg/g和 62%。

除此之外,生物大分子在膜表面的存在形态、覆盖量和本征性质都会影响固定化酶的最终性能。王振刚等[30]分别用牛血清白蛋白 (BSA)和胶原 (collagen)改性丙烯腈-丙烯酸共聚物(PANCAA)纳米纤维膜,然后用于固定过氧化氢酶 (catalase)。研究发现,过氧化氢酶的活性和载酶量依赖于BSA和胶原在膜表面的覆盖率、形态和固定方法 (如图 3所示)。由于胶原为纤维状结构,能较好地覆盖纤维膜表面,因此载酶量随胶原浓度的变化较小;而 BSA为心形结构,在膜表面的覆盖密度随 BSA浓度增加而增加,由此影响载酶量的变化。另外,戊二醛(GA)作为偶联剂,只能与酶蛋白分子的氨基共价结合,而不与膜表面的羧基作用,因而能有效消除酶与膜表面的直接作用,从而稳定酶的活性。

图3 PANCAA纳米纤维膜表面固定过氧化氢酶的示意图

2.3 电子传输性质

对于特殊的酶类,除膜形态和表面性质外,给予一定的辅助机制有助于酶催化功能的体现。氧化还原酶是一类促进作用物氧化和还原的酶类,主要有乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。这类酶的催化过程涉及电子转移,因而要求载体具备一定的电子传输能力或建立电子传输通道。对于非导电高分子,掺杂具有导电功能的无机纳米粒子可以实现导电通路的建立,碳纳米管尤为常见[31]。

王振刚等[32-33]将 PANCAA与多壁碳纳米管(MWCNTs)复合制备纳米纤维膜,不仅提高了过氧化氢酶的载酶量,而且当MWCNTs的掺杂量为 30%时,酶活性提高 42.9%。这种显著提高被认为是MWCNTs在过氧化氢酶催化过程中发挥着电子给体和受体的作用,促进了电子的转移,其可能的机理如图4所示。万灵书等[34]进一步研究了卟啉复合对 PANCAA纳米纤维膜固定化酶的改性效果,结果表明当卟啉和MWCNTs同时与 PANCAA复合时,过氧化氢酶活性提高幅度可达 49.5%。

图4 PANCAA/MWCNTs纳米纤维表面过氧化氢酶催化反应的电子转移示意图[32]

除碳纳米管外,金纳米颗粒是一种理想的纳米材料。一方面,它具有良好的生物相容性,常被用作酶、抗体、DNA的载体;另一方面,它具有优良的导电性,可作为酶催化的电子转移桥梁。Marinov等[35]在设计乙酰胆碱酶传感器时,将金纳米颗粒与丙烯腈共聚物膜复合,提高了传感器的响应性。

3 聚丙烯腈分离膜表面固定化酶的应用

酶-膜反应器和酶-膜生物传感器是固定化酶膜的两个重要的应用领域。酶-膜反应器结合了酶的生物催化功能和膜的分离作用,使催化反应和产物分离同时进行,加速反应,提高转化率。而酶-膜生物传感器利用信号转换器将酶生物催化信息转化成可测量的光、电等信号,用于检测样品的组成。对于聚丙烯腈分离膜表面的固定化酶而言,目前已有学者在酶-膜反应器和膜生物反应器方面进行探索尝试[14,16,36-37]。黄小军等[14]将脂肪酶固定于丙烯腈-甲基丙烯酸 2-羟乙酯共聚物(PANCHEMA)纳米纤维膜并制成酶-膜反应器,尝试了其在硝基苯棕榈酸酯水解方面的应用。对于固定的载酶量和反应条件,当底物流速从0.2mL/min提高至2mL/min时,转化率由 3.6%降至 1.8%。Li等[37]以脂肪酶固定化聚丙烯腈纳米纤维膜为反应器,在大豆油水解的最佳条件下,反应 1.5h后其转化率可达到 85%。除脂肪酶外,Vasileva等[16]还探讨了固定化辣根过氧化氢酶在苯酚水解方面的应用。

4 结束语

近 30年来,人们在聚丙烯腈分离膜的设计制备、多种酶的固定化、以及酶活性和稳定性的提高方面取得了显著进展,并逐渐在酶-膜生物反应器和传感器的设计试验方面开展相关工作。聚丙烯腈分离膜表面的酶固定化研究还将继续向高活性、高稳定性、多样性等方面发展,最终实现工业化应用。

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国家高技术研究发展计划资助课题(2007AA10Z301)

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