中药活性成分对血栓素A2受体抑制作用的分子模拟

刘海波 崔 巍 徐 峻 彭 勇,* 周家驹 肖培根

(1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193; 2中国科学院研究生院化学与化学工程学院,北京 100049; 3中山大学药学院,广州 510275;4中国科学院过程工程研究所,北京 100190)

中药活性成分对血栓素A2受体抑制作用的分子模拟

刘海波1崔 巍2徐 峻3,*彭 勇1,*周家驹4肖培根1

(1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193;2中国科学院研究生院化学与化学工程学院,北京 100049;3中山大学药学院,广州 510275;4中国科学院过程工程研究所,北京 100190)

中药中黄酮类化合物和白藜芦醇等活性成分对血栓素A2受体具有抑制作用,但具体机理不详.本研究通过同源模建方法,以墨鱼视紫红质蛋白为模板,构建血栓素A2受体的蛋白质结构模型.并使用分子对接方法研究中药活性成分白藜芦醇和芹菜苷元与血栓素A2受体模型的作用方式,据此建立药效团模型,筛选其他潜在的血栓素A2受体抑制剂.结果表明:白藜芦醇等中药活性成分能与血栓素A2受体活性口袋中的残基发生氢键作用,结合方式与血栓素相似.血栓素与Ser201、Leu198、Arg295和Thr298发生氢键作用,白藜芦醇等活性成分与Ser201、Leu198和Arg295发生氢键作用.建立的药效团模型由7个药效元素以及排斥性空间元素组成,经测试对高活性的血栓素A2受体抑制剂有比较好的选择性.使用该药效团模型对中药天然产物数据库进行筛选,命中了一批可能具有血栓素A2受体抑制作用的活性化合物.其中一些已经报道有抑制血小板凝聚活性.本研究表明血栓素A2受体可能是活血化瘀类中药的一个潜在的靶点.

中药; 药物靶标; 血栓素受体; 活血

血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)是花生四烯酸代谢通路的产物之一,由前列腺素H2(prostaglandin H2,PGH2)在TXA2合成酶(thromboxane A2 synthase, TBXAS)的作用下发生异构化生成,该反应主要发生在血小板中.TXA2结构不稳定,很快水解成为血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)(图1),半衰期只有30 s[1].TXA2是与血小板聚集相关的重要内源性激素,通过作用于血栓素A2受体(thromboxane A2 receptors,TP)促进血小板凝集.PGH2也有类似活性,而水解产物TXB2没有该作用[2].

自从上个世纪70年代被发现以来,TXA2一直是心血管药物开发的重要研究对象[3].前期研究重点放在对TBXAS抑制剂的开发上,后来发现由于TXA2前体PGH2也能促进血小板聚集,因此单纯抑制TBXAS活性并不能降低血栓形成.90年代以后,研究重点转向了TXA2/PGH2共同受体抑制剂,以及TBXAS和TP双抑制剂的开发上[4-5].已经证实TP抑制剂可以有效降低TXA2和PGH2的血小板聚集和血管收缩作用[6].

TP属于G蛋白偶联受体超家族(G-protein-coupled receptor,GPCR).GPCR在化学药物的研发中占有重要地位,GPCR为靶标的药物占有很高的市场份额[7].该家族一级序列相似性不高,但具有高度的结构相似性,每个受体都是单亚基膜蛋白,由7个α螺旋跨膜区(transmembrane,TM),3个外袢(extracellular loop,eLP),3个内袢(cytoplasmic loop,cLP),1个细胞外N末端和1个膜内C末端构成[8].

TP的蛋白质结构研究有较长的历史[9],但到目前为止还没能通过实验方法获得蛋白质晶体.Ruan等[10-11]使用核磁共振方法得到了eLP2和eLP3在溶液中的构象,并据此通过分子模拟软件,构建了TP与小分子结合的活性口袋[12].TXA2与TP作用方式的研究一般使用与TXA2结构相似的不易水解的化合物[9,13],通过突变、光亲合标记和特异位点抗体等方法寻找与配体发生作用的关键残基[14-15].

中药中的黄酮类化合物[16]和白藜芦醇[17-19]被报道对TP有抑制作用,但是分子作用机制仍不清楚.由于这两类化合物有共同结构特征,因此很可能与TP有相似的作用方式.本研究拟通过同源建模方法构建TP的蛋白质结构,使用分子对接方法研究TXA2与TP的作用机制,之后进一步研究黄酮类化合物和白藜芦醇对TP抑制作用的机理,据此建立药效团模型,在中药天然化合物中寻找其他可能的TP抑制剂.

1 数据和方法

1.1 TP结构同源建模

1.1.1 软件和算法

同源建模工作在靶分子信息学平台(target informatics platform,TIP)上完成.该平台是由Eidogen-Sertanty公司开发的结构信息知识库[20],包括了来自SWISS-PROT和IPI(international protein index)的人、小鼠、大鼠的序列数据,以及PDB(protein data bank)数据库中晶体结构数据.目前共有超过75000个人类蛋白结构(包括已经发表的晶体模型和使用STRUCTFAST建立的模型)和超过125000的活性位点信息.

图1 血栓素A2(TXA2)代谢反应Fig.1 Metabolic reactions of thromboxane A2(TXA2)TBXAS:thromboxane A2 synthase

STRUCTFAST(structure realization utilizing cogent tips from aligned structural templates)是TIP特有的用于蛋白质同源建模的一种算法.该算法利用一种新的动力学程序引擎,将同族蛋白结构特征信息结合到比对过程中,能够筛选蛋白质序列间的弱的相似性.有研究证明,STRUCTFAST和专家同源建模的结果相当或者更好[21].由于TP所属的GPCR家族具有序列一致性低,结构相似性高的特点,因此更适合使用STRUCTFAST进行建模.

1.1.2 操作及模板选择

TIP平台每次收录新的蛋白质序列后,会计算该序列与目前所有的蛋白质晶体结构的序列一致性,寻找最合适的模板进行同源建模.登录TIP平台,使用TP受体序列P21731-2(SWISS-PROT编号)建立同源模型TP model,使用的模板为墨鱼视紫红质蛋白(PDB编号:2z73)[22-23]的A链,序列一致性为15%,该模板也属于GPCR家族.

1.1.3 动力学优化

应用AMBER03力场参数处理蛋白质分子,并应用gaff力场处理配体分子,配体分子电荷使用Gaussian 03[24]计算,应用静电势收敛算法,在分子力学优化的结构上进行单点计算以确定各原子上的电荷.分子动力学模拟计算以AMBER 10软件[25]运行,应用tleap程序添加缺失的氢原子,体系以削角正八面体的TIP3P水周期盒子包裹,根据体系静电势分布,在正电势最集中区域加入7个Cl-离子使体系总电荷平衡.

首先对体系进行能量优化,能量优化分三步进行:第一步约束蛋白质和配体分子中的重原子,优化全部溶剂分子和溶质分子中的氢原子;第二步约束蛋白质骨架重原子,优化全部侧链原子和氢;第三步自由优化全部原子.优化结束后,开始进行分子动力学模拟,首先在60 ps时间中分7步应用温度耦合算法将体系从0 K升温至310 K,随后在310 K进行稳态模拟,应用shake算法稳定含氢化学键,应用PME算法处理长程静电相互作用,动力学模拟步长选为2 fs,每隔0.2 ps输出一次轨迹构象和体系能量等信息.最终运行了6 ns模拟,从轨迹中选取势能稳定阶段的平均构象作为分子动力学优化结果.

1.2 TXA2的分子对接及结合模式分析

用molecular operating environment(MOE)[26]进行配体-受体对接研究,步骤如下:(1)将由TIP建立的模型导入MOE,根据TP结构的相关实验研究结果进行相应调整,使用AMBER99力场进行能量优化;(2)导入TXA2分子,使用MMFF94x力场进行构象能量优化;(3)以模板蛋白中的配体分子视黄醛(retinal)为小分子模板,使用 MOE中的 flexible alignment模块将TXA2与之进行叠合,产生一个叠合构象库,从中根据经验选择最合理的几个构象作为TXA2在TP中的初始构象;(4)选取TXA2分子和受体活性口袋中0.8 nm范围内的氨基酸残基,其余部分固定,使用MMFF94x力场进行能量优化; (5)使用potential energy模块计算结合自由能,使用ligand interactions分析活性小分子与活性口袋中残基间的相互作用;(6)取叠合构象库中TXA2的其他构象,重复步骤4、5,将结果与实验研究进行比较,最终确定最合理的结合模式.

1.3 黄酮和白藜芦醇对TP抑制的分子对接研究

基本步骤与1.2相同,黄酮类化合物选择活性最高的芹菜苷元(apigenin)作为研究对象[16],芹菜苷元和白藜芦醇的初始位置和构象参考1.2节得到的模型中TXA2的结合方式.

1.4 TP抑制剂药效团模型的建立及数据库筛选

1.4.1 ATCMD数据库及3D构象库的建立

ATCMD(annotated traditional Chinese medicine database)是根据《中药原植物化学成分集》[27]中的数据建立的小分子库.该书收集整理了中外科学家发表的5507篇(部)文献中的中药成分化合物23033个,涉及药用植物6760种,其中7819种化合物有药理实验数据.该数据库的化合物结构非常精准可靠,药理数据也比较丰富,因此本研究采用该数据库作为药效团筛选对象.首先将数据库中全部化学结构导出到sdf文件,之后使用德国Mol-Net公司Corina软件[28]生成低能构象库,每个分子除了生成最低能量构象外,还在最低能量构象以上84 kJ·mol-1范围内保留最多20个低能构象.原数据库23033个分子共生成255879个构象结构,构象库使用MOE database管理.

1.4.2 建立抑制剂药效团模型

使用MOE的Ph4 query editor模块建立药效团模型.由于MOE在药效团建立过程中不考虑小分子的生物活性,侧重于寻找小分子间三维结构的相似性,所建立的药效团模型比较类似于目前流行的药效团软件CATALYST[29]建立的common features hypotheses.这种算法比较适合于在配体小分子数量比较少或者缺少充足的活性数据的情况下建立药效团模型.MOE在建立药效团的过程中能加入受体口袋的空间因素,因此所建立的药效团模型可以快速筛选到体积适合,并且具有相似三维构象的分子,但不能对生物活性进行预测.

具体步骤如下:(1)从1.3节建立的模型中分离出芹菜苷元和白藜芦醇分子,保持构象叠合在一起; (2)在 Ph4 query editor中设定 PCHD(polaritycharge-hydrophobicity-direction)药效元素组合,使用Consen-sus tool枚举出所有可能的药效团元素;(3)结合1.3节中小分子与TP相互作用模式及相关实验研究结果,选择药效团元素组合方式,并对每个元素的体积等条件进行调整;(4)选择TP活性口袋中与配体小分子距离0.6 nm范围内的氨基酸残基,据此建立排除体积(excluded volume)模型.

为了考查建立药效团模型的选择效率,建立了一个测试数据集.根据文献报道[16],收集了20种黄酮类化合物,对TP的抑制率在0%-64%之间.使用与1.4.1节中相同的方法建立测试分子3D结构数据库,使用建立的模型对数据库进行药效团筛选,根据命中分子的情况调整药效元素直到确定最好的药效团模型.

1.4.3 3D分子库的药效团筛选

在MOE database的Ph4 database search模块中使用1.4.2节中生成的药效团模型对ATCMD构象库进行筛选,对命中的天然产物的化学结构类型和药理活性进行分析整理.

2 结果与讨论

2.1 TP同源建模结果

Ramachandran图是蛋白质主链的ψ-φ角度分布图,是蛋白质构象合理性的一种直观的表述.如果高能角出现频率过高,则说明该构象不合理或者与实际构象差别比较大.MOE的protein geometry模块能对蛋白质构象生成四种Ramachandran图[30],分别对应于一般氨基酸,甘氨酸,脯氨酸和前脯氨酸(pre-proline),多数高能角出现在一般氨基酸图中.对经过能量优化的同源建模模型TP model及其模板2z73A作Ramachandran图(图2).可以看到,模板蛋白质只有一个高能角,TP model在一般氨基酸图中有9个高能角,只占总数的2.7%,主要分布在内袢和外袢区,7个过膜区没有高能角,可以认为由TIP建立的模型基本上是合理的.

由TIP模型为基础进行动力学模拟,结果显示体系的势能在500 ps内达到稳态状态.均方根偏差(RMSD)1000 ps后也基本达到平衡状态(图3).对最终得到的平均能量构象进行稳定性分析,发现高能角的数量由9个降低到3个(图2),说明模型已经得到了优化,非常稳定,可以进行下面的分子对接研究.

2.2 TXA2对接结果

TXA2与TP的对接结果显示(图4),TXA2与TP的结合部位位于第三外袢以下,7个过膜螺旋之间的部位,分子的羧基端与Arg295形成两个氢键,与Thr298形成一个氢键,羟基端与Ser201和Leu198形成一个氢键.结合自由能也比较大,达到-633.14kJ·mol-1,TXA2与TP间的静电作用为主要作用力(表1).

图2 同源建模模型和模板的蛋白质构象以及Ramachandran图Fig.2 Conformation and Ramachandran plots of homology model and templateTIP:target information platform,MD:molecular dynamics

文献中TXA2与TP结合模式的实验研究结果主要有:(1)TXA2类似物和受体特异性拮抗作用发现,TP的配体结合部位为TM5的Ser201与TM7的Arg295之间的一个疏水性口袋[31],从图4a可以看到对接模型与该实验结果吻合;(2)TXA2及其类似物的羧基与Arg295,羟基与Ser201发生氢键作用,而分子中央的疏水性部分位于受体的疏水性口袋中[31],从图4b看,模型与实验吻合;(3)Turek等[14]用光亲合标记法和特异位点抗体法研究发现,第三外袢Cys183到Asp193是直接参与TP和配体结合的氨基酸序列,从图4c看,模型中TXA2正位于eLP3的Cys183到Asp193的部分之下,与该段肽链有紧密的作用,与实验吻合;(4)Ruan等[13]使用PGH2相似分子进行对接研究发现,TP和配体结合时,配体的两条臂充分打开,羧基一端尽量伸展,羟基一端在羟基以外的碳链向回折,形成一种长方形的形式与TP结合,从图4d看,模型中的TXA2分子的构象与实验基本吻合.

表1 分子对接的结合自由能Table 1 Binding free energy obtained from docking results

图5 芹菜苷元和白藜芦醇与TP受体间的对接结果Fig.5 Docking results for the apigenin,resveratrol and TP(a)hydrogen bond interaction;(b)docking result

综上所述,本研究得到的对接模型与上面四个实验结果都保持一致,因此认为这种结合方式比较符合实际情况.

2.3 芹菜苷元和白藜芦醇的分子对接结果

结果显示,芹菜苷元和白藜芦醇以相同的方式结合到 TP活性口袋里,与 Ser201、Leu198和Arg295发生氢键作用(图5).这种作用方式与TXA2相似,不同之处在于没有与Thr298产生氢键的作用.从结合自由能看,白藜芦醇的结合强度比较大,芹菜苷元较弱(表1).

图6 芹菜苷元和白藜芦醇的药效团模型Fig.6 Pharmacophore model for the apigenin and resveratrolF1,F2:hydrogen bond acceptor;F3:hydrogen bond donor&acceptor; F4:hydrogen bond acceptor 2;F5:hydrogen bond donor 2; F6:hydrogen bond donor 2/acceptor 2;F7:hydrophobes/aromatic

图7 药效团模型性能测试结果Fig.7 Test results for the pharmacophore modelNHDC:neohesperidin dihydrochalcone;the hit compounds have been marked with asterisk.

GPCR激动剂和抑制剂有不同的结合方式,前者能够引起跨膜螺旋区发生重排,从而改变细胞内C端的构象,暴露出偶联G蛋白识别位点,最终与G蛋白形成复合物.而抑制剂不能引起相应的构象变化,因此使GPCR的活性受到抑制[8].分子对接研究的结果显示,TXA2与TP作用于Ser201、Leu98、 Arg295和Thr298,而芹菜苷元和白藜芦醇等抑制剂与Ser201、Thr298、Arg295均有氢键作用,但没有与Thr298形成氢键.这种结合方式的差异可能导致了TP构象的不同变化.因此,TXA2对TP有激活作用,芹菜苷元和白藜芦醇等抑制剂不能激活TP,而且对TXA2产生了竞争性抑制作用.这可能是抑制作用的分子机理.

2.4 药效团模型及筛选结果

2.4.1 芹菜苷元和白藜芦醇的药效团模型

如图6所示,建立的药效团模型由7个药效元素构成,F1、F2、F3为氢键受体或者给体,F4、F5、F6为外部氢键受体或者给体,分别对应于芹菜苷元和白藜芦醇两端与受体发生氢键结合的位置.其中, F2-F5限制比较严格,半径在0.03-0.05 nm之间. F1和F6比较宽松,半径为0.15 nm.中间疏水部分由一个疏水/芳香元素F7构成,半径均为0.6 nm.此外还根据受体活性口袋建立了排斥性空间元素,每个空间元素的半径为0.13 nm.

2.4.2 药效团筛选及结果分析

使用药效团模型对测试数据库中20个化合物进行筛选,共命中10个化合物(图7).检中的化合物多数集中在抑制率20%以上的活性区,抑制率小于5%低活性化合物没有发生误检的情况,说明该药效团模型对天然产物中的TP抑制剂有一定的筛选能力,可以满足初步筛选的需要.但是仍有一些问题存在,例如对黄酮骨架的依赖性比较强,因此对于genistein等异黄酮结构的化合物预测能力较差.使用药效团模型对ATCMD-3D构象库进行筛选,共命中261种化合物,其中8种有报道具有抑制血小板聚集活性.其他命中的分子是否有TP抑制作用,还有待进一步研究.

3 结 论

中药药效的物质基础研究是中药现代化的重要组成部分,中药作用的靶点分析又是中药物质基础的重点研究方向.本文通过同源建模方法,建立了血栓素A2受体蛋白的结构模型,模拟了血栓素与受体的作用方式,并与实验结果比对验证了该模型的可靠性.据此,进一步分析芹菜苷元和白藜芦醇对TP的抑制机理,并构建了抑制剂的药效团模型,在ATCMD构象数据库中进行筛选,命中了一批可能具有TP抑制活性的天然产物.研究结果显示,TP很可能是中药活血作用的重要靶标.这个结果对基于中药的先导化合物发现和新药开发有一定的启发作用,更深入的研究将在今后逐步展开.

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Molecular Simulations of the Inhibition of Active Components in Traditional Chinese Medicine on the Thromboxane A2 Receptor

LIU Hai-Bo1CUI Wei2XU Jun3,*PENG Yong1,*ZHOU Jia-Ju4XIAO Pei-Gen1
(1Institute of Medicinal Plant Development,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193,P.R.China;2College of Chemistry and Chemical Engineering,Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,P.R.China;3School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,P.R.China;4Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

Some natural products from traditional Chinese medicine(TCM)such as flavones and resveratrol have been reported to have thromboxane A2 receptor(TP)inhibiting activity.We investigated a possible inhibition mechanism by a homology model of TP,which was built based on the crystal structure of squid rhodopsin.After that,docking methods were used to investigate the binding modes of resveratrol and apigenin in the active pocket of TP.Furthermore,a threedimensional pharmacophore model was generated for screening other potential natural TP inhibitors.The results indicate that resveratrol and apigenin bind to the active site of TP similar to the way that thromboxane A2 binds to Ser201,Leu198,Arg295,and Thr298.The former three key residues can form hydrogen bonds with the inhibitors.The pharmacophore model consisted of seven features and a set of volume spheres,which has been proven to be efficient in identifying compounds with high TP inhibition activity.In this way,a set of potential TP inhibitors were screened from a natural product database.Some of them were reported to have platelet aggregation inhibiting activities.This research indicates that TP could be an important target of TCM drugs with blood circulation activation effects.

Traditional Chinese medicine;Drug target;Thromboxane A2 receptor; Blood circulation activating

O641

Received:February 10,2010;Revised:May 5,2010;Published on Web:July 7,2010.

*Corresponding authors.XU Jun,Email:junxu@biochemomes.com.PENG Yong,Email:ypeng@implad.ac.cn;Tel:+86-10-51296683,+86-10-62894462.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(30530860).

国家自然科学基金重点项目(30530860)资助

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