大鼠脂肪干细胞的培养及向神经细胞的定向分化

周向阳 ，邓永文 ，方 芳，王 飞，宋 涛，方加胜

（1.郴州市第一人民医院 神经外科，湖南 郴州 423000；2.中南大学湘雅医院 神经外科，湖南 长沙410000；3.湖南省人民医院 神经外科，湖南 长沙 410000）

随着近年来组织工程学的飞速发展，种子细胞的获得作为组织工程学的第一大要素，已经将重点放在了成体干细胞的研究上，数以千万计的学者数十年来一直致力于理想干细胞的寻找工作。美国的ZUK等人在2001年提出了脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）的概念，将其向骨、软骨、肌肉和脂肪细胞进行诱导分化的研究也已取得了成功[1]。神经组织包括的细胞种类较复杂且涉及和神经干细胞（NSC），而且鲜有这方面的研究，故ADSC是否真正能够分化为神经细胞、分化后的细胞在形态和表型上会发生怎样的变化尚需我们去探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验动物均由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供的体重180～200 g的健康SD大鼠（雌雄不限）

1.2 主要试剂

DMEM培养基粉剂（美国Gibco Corp.），重组人表皮生长因子（EGF）（PeproTech EC Ltd），重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）（PeproTech EC Ltd），B-巯基乙醇（BME）（PeproTech EC Ltd），左旋谷氨酰胺（Invitrogen Corp.），注射用胰岛素（Amresco，Inc），二甲基亚砜（DMSO）（Amresco，Inc），左旋多聚赖氨酸（江苏万邦生化医药有限公司），ABC法免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），兔抗人GFAP多克隆抗体（武汉博士德公司），兔抗人NSE多克隆抗体（武汉博士德公司），小鼠抗人CD44单克隆抗体（武汉博士德公司），CY3标记羊抗小鼠IgG（武汉博士德公司）。

1.3 脂肪组织的取材

取SD大鼠，麻醉满意后取腹股沟和腹膜后脂肪组织膜后脂肪组织约3 g，置于无菌玻璃小瓶中并用PBS及青、链霉素溶液洗3遍。

1.4 ADSC的分离和原代培养

用眼科显微剪将脂肪组织剪碎为1mm3大小；3 mL 1%Ⅰ型胶原酶加入已剪碎的脂肪组织中，37℃消化1 h，每10min摇晃1次；加入10mL 15%含血清DMEM细胞培养基终止消化并稀释；不锈钢筛网（74μm孔径）过滤含ADSC浊液，滤去组织残块；离心管收集滤液，加入红细胞裂解液2 mL后1 200 r/m离心15 s；离心后滤液分为3层，上层较薄为密度较低的白色泡沫状脂质层，中层为液体层，底层为细胞层，肉眼可见少许白色絮状物；移去上层和中层，加入5mL 15%含血清DMEM细胞培养基吹打重悬后，移入50mL塑料无菌细胞培养瓶，相差倒置显微镜下观察原代ADSC形态。

1.5 ADSC的传代培养

原代ADSC置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱培养，3 d观察1次并换培养液，观察时拧紧瓶盖，放入培养箱时稍松瓶盖。待细胞生长融合后传代，超净工作台内倒去培养基，加入1mL 0.25%胰蛋白酶倾斜瓶底使其均匀覆盖瓶底，1min后倒去胰蛋白酶并加入含血清培养基吹打瓶底细胞，相差倒置显微镜下观察，直到大部分细胞回缩成球并与瓶底分离。按1︰2比例将细胞悬液移至另外2个50mL细胞培养瓶，后3～4 d相同方法传代1次，观察ADSC形态。

1.6 ADSC表型鉴定干细胞标志物CD44的表达

用免疫荧光法检测干细胞标志物CD44在ADSC的表达情况，取第3代细胞胰蛋白酶消化制成细胞悬液，适宜密度接种于已用多聚赖氨酸包被的盖玻片，置于12孔细胞培养板加入含血清培养基培养。24 h后细胞贴壁并伸展完全，行免疫荧光染色：细胞爬片固定破膜后，BSA封闭，加入CD44一抗4℃过夜，Cy3标记的二抗孵育1 h，封片后用短波长蓝色激发光观察，并用数码相机拍摄高倍镜下（×200倍）细胞荧光表达情况。

1.7 ADSC的贴壁率的研究

取第3代生长情况较好的ADSC细胞，同上法制成单细胞悬液，以2×105/孔密度接种于24孔细胞培养板。此后，每2 h共12次取其中3孔，移去培养液，将贴壁细胞制成悬液计数数量，按公式：贴壁率（%）=贴壁细胞数/接种细胞数×100%计算三孔贴壁率和平均贴壁率。这些数据可以反映ADSC在接种后24 h内的贴壁情况。

1.8 MTT比色实验测定ADSC生长曲线

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶的甲赞，经DMSO溶解后可测其光吸收值，利用MTT产物与细胞数成正比的关系检测细胞生长曲线。取第3代生长情况较好的ADSC细胞，消化吹打制成单细胞悬液，以2×103/孔密度接种于96孔细胞培养板并培养，根据贴壁率结果自接种后24 h，每天取出其中3孔进行MTT比色直到细胞数减少。每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培基上清液，每孔加入150μL DMSO并震荡10 s，使甲赞充分溶解。选择492 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值。以时间为横轴，每次3孔的平均光吸收值绘制ADSC细胞生长曲线。

1.9 ADSC预诱导和诱导剂的配制

预诱导剂：NMPP+2 nmol/L BME+无血清DMEM 培养基 NMPP 成分：（DMEM）：HAMS F12（50︰50）+bFGF 20 ng/mL+EGF 20 ng/mL+N2；1︰100诱导剂：10 nmol/L BME+无血清DMEM培养基。

1.10 ADSC的诱导分化

分别取制备的细胞爬片2片用于诱导分化，诱导分化步骤：预诱导24 h+诱导剂5 h。分化过程中每隔数小时动态观察一次ADSC的形态，对诱导后的ADSC细胞爬片进行NSE、GFAP免疫荧光染色，鉴定ADSC的分化结果。分别设置阴性和阳性对照，荧光显微镜下观察结果，用蓝色激发光观察GFAP染色情况，用绿色激发光观察NSE染色情况。

1.11 ADSC分化过程中Nestin的动态表达的半定量统计分析

取4片ADSC细胞爬片进行预诱导，加入预诱导剂后，分别在第6、12、18和24 h取出其中的一片，对其进行Nestin免疫组化染色：染色完毕后显微镜下观察，寻找Nestin阳性细胞。Nestin为细胞浆-细胞膜型表达方式，以细胞轮廓出现棕色染色为阳性细胞。每个爬片随机取5个非重叠高倍视野进行Nestin阳性细胞和总细胞数计数，并计算Nestin阳性细胞率。结果用SPSS11.0统计软件包进行分析，采用其中多个样本率的χ2分割检验法，根据要求计算检验水准P为0.007。

2 结果

2.1 ADSC细胞形态

刚从脂肪组织分离的原代ADSC细胞在相差倒置显微镜下呈单细胞悬浮状态，体积较红细胞大、椭圆形，胞核稍暗。观察发现，原代接种3 h后开始贴壁，并在48 h内开始伸展。约96 h完全伸展后，细胞形状为细长梭状，胞核位于中央与胞浆对比明显，严格按贴附方式生长，此时在外形上和骨髓干细胞难以区别。细胞以集落形式增殖，7～8 d后细胞生长汇合并停止生长（图1），每一代细胞之间无明显形态学差异。

图1 生长汇合的ADSC，长梭形，贴壁生长（×200）

图2 ADSC的CD44免疫荧光染色呈强阳性（×200）

2.2 ADSC表达CD44

免疫荧光法检测到ADSC强阳表达CD44（图2），为胞浆表达形式，细胞轮廓被荧光清晰衬托。

2.3 ADSC的贴壁率

表1 接种24 h内ADSC的贴壁率

说明传代培养的ADSC能在接种后的24 h内贴壁完全。

2.4 ADSC的生长曲线

采用MTT法测定的细胞生长曲线（图3）较真实的反映了其生长情况，从曲线上可以看出，ADSC生长活跃，增殖能力强，具有对数生长型的曲线模式且对数生长期明显。在完全贴壁第9天后，细胞数目不再增加，采用绘图法得出其倍增时间为4 d。

图3 ADSC生长曲线

2.5 ADSC向神经细胞的定向分化

ADSC在预诱导阶段形态变化不明显，在加入诱导剂后仅1 h，就可见部分细胞开始由梭状变为椭圆形，并向周围伸出数个较长突起（图4），在诱导结束后，几乎所有细胞均表现为神经元的外形，突起明显，细胞密度较诱导前变化不大，未见胶质样细胞。ADSC在分化结束后明显表达NSE而不表达GFAP（图 5）。检测 ADSC 预诱导后 6、12、18和 24 h Nestin阳性细胞的比例，结果用（均数±标准差）（±s）形式表达，以0.007为检验水准P，每两个率的均数分别行χ2检验。可见，Nestin阳性细胞胞浆均匀呈棕色，与背景区别明显，胞核清晰且便于计数（图6），阴性和阳性细胞形态无明显差别，未见明显非特异性着色。SPSS11.0统计软件包进行分析，P值均小于0.007，故认为每个时间点的Nestin阳性细胞率差异有显著性（表2）。可以认为，在预诱导ADSC向神经细胞分化的过程中，逐渐减弱对标志NSC的Nestin的表达，提示ADSC的分化机制中缺乏经历NSC再沿着后者的分化路径分化的证据。

图4 诱导1 h可见有细胞变为神经元形态，并向周围伸出突起（×200）

图5 诱导结束后，ADSC分化为神经元强烈表达 NSE（荧光染色）（×200）

表2 不同时间点的Nestin阳性率（±s）

表2 不同时间点的Nestin阳性率（±s）

时间（h）612 18 24 Nestin阳性率%21.83±1.99 16.51±2.73 12.68±1.39 9.80±2.78

图6 ADSC预诱导6 h后Nestin免疫组化染色，阳性细胞呈棕黄色（×200）

图7 ADSC预诱导24 h后Nestin免疫组化染色，阳性细胞呈棕黄色（×200）

3 讨论

脂肪组织和骨髓同属中胚层，科学家们渴望在脂肪中发现类似骨髓干细胞的细胞。最早的研究是基于抽脂手术获取的脂肪组织。普通的脂肪细胞在体外培养中悬浮生长，而有少部分梭状呈贴附生长的亚群有相当的分裂增殖能力，最早称其为脂肪组织提取细胞（processed-lipoaspirate cells，PLAC）。后来，逐渐明确其亦有多向分化的潜能。ZUK等人通过检测相关分子的表达，排除了脂肪组织中存在软骨、骨、肌细胞等存在的可能[1]。目前已有研究证实这是一类全新的干细胞，称其为ADSC[2，3]。已证明ADSC稳定表达 HLA-ABC、CD44、CD106、CD166等分子[4]，但尚无特异性很高的表面标志可用于鉴定，故对前者的认定需结合其活跃稳定的增殖能力、多向的分化潜能和CD44等干细胞所普遍表达的表面分子等多方面因素综合考虑。

ADSC取材于细胞成分单纯的脂肪组织，可以在持续自我复制增殖和传代。CD44是目前所发现的成体干细胞最广泛表达的标志物[5]，分布于胞膜和胞浆，它的存在可以进一步证明干细胞的身份。尽管对于干细胞的定义不强调细胞的表型，但对于其表型的研究可以为我们在细胞筛选、探究细胞亚群等工作中提供帮助。实验中观察到ADSC强烈表达CD44，可以回顾性的支持对于ADSC干细胞的命名。贴壁率和生长曲线是细胞生长特征的重要指标，在传代后24 h其贴壁率为96.6%，其贴壁速度之快和效率之高远超过大多数培养细胞。在后续的细胞培养工作中，可以充分利用这种特点，即在传代后不久就可行其它处理，为我们提高工作效率提供了理论的支持。ADSC的生长过程呈典型的对数生长，三个生长阶段明显对称，其倍增时间仅4 d，足以衬托其分裂的高效率。也能够解释在将ADSC向神经细胞预诱导时，丝裂原bFGF可以在短期内使ADSC数量明显增加。

美国加利福尼亚大学的ZUK等人于2001年最早尝试将ADSC向神经方向诱导分化，他们使用10%FBS DMEM 诱导剂（5μg/mL胰岛素+200μM吲哚美辛+0.5mM二甲基亚甲基黄嘌呤）。持续诱导ADSC 2周，有43%的细胞分化为神经元[6]。后来发现，这种诱导方法不仅费时，而且诱导分化效率不高。本文借鉴了WOODBURY鸡尾酒式的分阶段诱导方式[7]，而且在预诱导剂中加入了含较高浓度神经营养因子的神经祖细胞维持培养基（NPMM）以减少诱导剂对分化中细胞的毒性[8]。本实验中分化后的细胞免疫荧光染色仅表达神经元特异性标志物NSE，而不表达胶质细胞标志物GFAP，说明经以上方法诱导后，ADSC大多分化为神经元，而不向胶质方向分化，这与形态学的观察结果相符合。我们观察ADSC分化的过程中，神经干细胞特异性标志物Nestin表达率是逐渐下降，所以ADSC的分化径线与机制与骨髓干细胞是有差别的，前者不经历神经干细胞的中间阶段，因而分化产物中也没有神经胶质细胞。

ADSC来源充足，培养方便而且易于向神经元诱导分化，有望成为我们解决中枢神经系统神经元难以再生的有利工具。

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