海蜇皮水解条件的研究

张绵松,袁文鹏,王小军,孟秀梅,夏雪奎,刘昌衡,＊

(1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东济南 250014; 2.山东省科学院生物研究所,山东济南 250014; 3.山东省科学院海洋食品生物技术研发平台,山东济南 250014)

海蜇皮水解条件的研究

张绵松1,3,袁文鹏2,3,王小军2,3,孟秀梅2,3,夏雪奎1,3,刘昌衡2,3,＊

(1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东济南 250014; 2.山东省科学院生物研究所,山东济南 250014; 3.山东省科学院海洋食品生物技术研发平台,山东济南 250014)

以肽含量为指标,对海蜇皮的水解用酶进行了选择,认为风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解效果较好,并对这两种酶进行了单因素实验,结果表明：底物浓度为 2%时,风味蛋白酶较好的水解条件为 45℃、pH6.0、加酶量 2700U/g,水解 90min,肽提取率可达 62.5%;真菌酸性蛋白酶较好的水解条件为 55℃、pH2.5、加酶量 2000U/g,水解 90min,肽提取率可达74.7%。

海蜇,胶原蛋白,肽含量,水解条件

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海蜇皮 山东荣成好当家集团提供;Alcalase 2.4L(酶活为 2.98×105U/mL)、复合蛋白酶 Protamex (酶活为 1.31×104U/g)、风味蛋白酶 Flavourzyme 500MG(酶活为 6.83×104U/g) 由诺维信公司提供;真菌酸性蛋白酶 (酶活为 2.55×104U/mL) 由山东隆大生物工程有限公司提供。

FK-A型组织捣碎机、JJ-1型增力电动搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;NPCa-02氮磷钙测定仪 上海洪纪仪器设备有限公司;HH-S21 -4S型电热恒温水浴锅 上海贺德实验设备有限公司;UV754N紫外可见分光光度计、pHS-25型 pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺 矾制海蜇皮→清水脱盐[6]→组织捣碎机捣碎→测定水分和蛋白质含量→冷藏备用

海蜇皮浆→加水,调节温度和 pH→加酶水解→100℃, 10min灭酶→调整 pH至 7.0→4000r/min,离心 10min→含肽和氨基酸的上清液

1.2.2 酶的选择 取适量的捣碎海蜇皮放入烧杯中,加入适量的缓冲液调节至所需底物浓度(蛋白浓度 2%),然后在所需的温度下水浴 15min使之温度均匀,加入 3000U/g的酶量启动反应。每隔 30min取 2mL水解液测定肽含量,以时间为横坐标,肽含量为纵坐标做一条水解趋势线。几种酶的具体的水解条件见表1。

表1 几种蛋白酶的水解条件

1.2.3 温度、pH、加酶量和酶的种类对肽含量的影响先固定 3000U/g的加酶量和酶的适宜 pH(真菌酸性蛋白酶为 pH3.0,风味酶为 pH7.0),温度均取 40、45、50、55℃四个实验点进行实验,确定各自较好的温度;然后固定较好的温度和 3000U/g的加酶量,真菌酸性蛋白酶选取 pH2.0、pH2.5、pH3.0、pH3.5、pH4.0五个实验点,风味酶选取 pH5.0、pH6.0、pH7.0和 pH8.0四个实验点进行实验,确定各自较好的pH;最后固定较好的温度和 pH,真菌酸性蛋白酶选取1000、1500、2000、2500、3000U/g五个实验点,风味酶选取 600、1300、2000、2700、3400U/g五个实验点进行实验,以确定各自较好的加酶量。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 蛋白酶活的测定 参照 SB/T 10317-1999。

1.2.4.2 蛋白质测定 参照微量凯氏定氮法[7]。

1.2.4.3 肽含量的测定 取 2mL水解液,加入 2mL 5%TCA(三氯醋酸),用双缩脲法测定肽的含量[7-8]。

1.2.4.4 肽提取率计算 计算公式如下：

肽提取率 (%)=水解上清液中的肽含量(mg/mL)×上清液总质量 (g)/1000×用于水解的蛋白总质量(g)×100%

2 结果与分析

2.1 酶的选择

由图 1可知,0～90min水解过程中,水解液中的肽含量随着时间的延长而增加,风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶的增加幅度大于另外两种蛋白酶。30min以内的水解速度明显大于 30～60min的水解速度,这是由于随着水解反应的进行,底物浓度降低,蛋白酶失活等因素的变化会使得酶的水解速度下降。90min以后,除了Alcalase,其它三种蛋白酶的水解曲线都有不同程度的下降,此外,复合蛋白酶和风味酶的水解曲线还有稍微的起伏,这是因为酶中的外切速度大于内切速度,部分酶解产生的肽被水解成氨基酸,所以使得曲线下降;同时大分子蛋白质也在水解产生肽,所以时而曲线会有起伏。总的来说,在同等水解条件下,真菌酸性蛋白酶和风味蛋白酶的水解效果明显好于其它两种蛋白酶,图 2表明水解 3h后,这两种酶的肽含量和蛋白提取率仍然大于其它两种蛋白酶,所以选择这两种蛋白酶作为海蜇多肽的水解用酶。因为在 90min以前,是内切起主导作用,肽含量呈上升趋势,所以选择 90min的水解时间来优化这两种酶的水解条件。

图 1 四种蛋白酶水解过程中肽含量随时间的变化曲线

图2 四种蛋白酶的水解效果

2.2 温度对肽含量的影响

风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解过程中肽含量随温度的变化分别见图 3和图 4。根据海蜇胶原蛋白的特性,海蜇在超过 50℃的水中,蛋白质开始硬化变性,部分卷曲;60℃时则卷曲变小,随着蛋白质的分子不对称程度变化,构象也变化,使得蛋白质的分子趋于纤维状[9],所以 50℃以后水解效果明显下降。风味蛋白酶水解肽含量在 45℃时明显高于其它温度,所以,选择 45℃作为风味酶的水解温度。然而胶原蛋白在强酸和强碱下具有的膨润特性[10]却使得其在 pH3.0的条件下的真菌酸性蛋白酶水解效果大不一样,图 4表明在 55℃时真菌酸性蛋白酶的水解肽含量最高,考虑到真菌酸性蛋白酶本身的热稳定性,所以选用 55℃作为真菌酸性蛋白酶的水解温度。

图 3 风味蛋白酶水解肽含量随温度的变化

2.3 pH对肽含量的影响

风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解过程中肽含量随 pH的变化分别见图 5和图 6。图 5表明,pH6.0时风味蛋白酶水解肽含量大于其它 pH条件,pH6.0为较好的水解条件。从图 6可知,真菌酸性蛋白酶的较好 pH条件为 pH2.5,这正好也是胶原蛋白产生最大膨润的 pH条件[10]。膨润后底物能更好地与酶结合,提高水解效率。

图 4 真菌酸性蛋白酶水解肽含量随温度的变化

图 5 风味蛋白酶水解肽含量随pH的变化

图 6 真菌酸性蛋白酶水解肽含量随 pH的变化

2.4 加酶量对肽含量的影响

风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶水解过程中肽含量随加酶量的变化分别见图 7和图 8。图 7曲线较为平缓,这说明加酶量对风味蛋白酶的影响并不是太大,较好的加酶量为2700U/g;真菌酸性蛋白酶在加酶量高于 2000U/g时肽含量有下降的趋势,可能提前进入肽的水解阶段。在考察的实验条件下,认为 2000U/g为真菌酸性蛋白酶的较好水解加酶量。

图 7 风味蛋白酶水解肽含量随加酶量的变化

图 8 真菌酸性蛋白酶水解肽含量随加酶量的变化

3 结论

在相同的加酶量和各自的较适水解条件下,风味蛋白酶和真菌酸性蛋白酶的水解肽含量要明显高于Alcalase和复合蛋白酶,通过单因素实验,认为以肽含量为指标,底物浓度为 2%时,风味蛋白酶较好的水解条件为：45℃,pH6.0,加酶量 2700U/g;真菌酸性蛋白酶较好的水解条件为：55℃,pH2.5,加酶量2000U/g。在较好条件下水解 90min,风味蛋白酶的肽提取率可达 62.5%,真菌酸性蛋白酶的肽提取率可达 74.7%。本实验结论可以为海蜇多肽的活性研究和产品开发提供参考。

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[2]曹文红,章超桦,秦小明 .酶解中国毛虾制备低分子肽的研究[J].食品与发酵工业,2006,32(11)：80-83.

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[6]崔静 .预混料型方便海蜇食品的研制[D]：江南大学食品学院,2008.

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[10]江晃荣 .胶原蛋白的惊人疗效 [M].台湾世茂出版集团,2002.

Study on the hydrolysis conditions of jellyfish

ZHANGM ian-song1,3,YUANW en-peng2,3,WANG Xiao-jun2,3, M ENG Xiu-mei2,3,XIA Xue-kui1,3,L IU Chang-heng2,3,＊
(1.Biotechnology Center of ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China; 2.Biology Institute of ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China; 3.Platform ofMarine Food Biotechnology,ShandongAcademy of Sciences,Jinan 250014,China)

Accord ing to the p ep tide content,the collec tion of enzym es for je llyfish was ca rried out,hyd rolyza tion of Flavourzym e and funga l ac id p rotease we re be tte r than the othe r enzym es.The results of s ing le fac tor exp e r im ent showed tha twhen the subs tra te concentra tion was2%,the be tte r hyd rolys is cond itions of Flavourzym e and funga l ac id p roteasewe re 45℃,pH6.0,enzym e dosage 2700U/g and 55℃,pH2.5,enzym e dosage 2000U/g, hyd rolyza tion t im e90m in,resp ec tive ly.Unde r these cond itions,the p ep tide extrac tion ra te was62.5%and74.7%, resp ec tive ly.

je llyfish;collagen;p ep tide content;hyd rolys is cond itions

TS254.1

B

1002-0306(2010)02-0258-03

海蜇,又名水母,属腔肠动物。新鲜海蜇含水量约为 96%,蛋白质含量约 2.92%,脂肪含量小于0.01%。除水外,蛋白质成为海蜇的主要成分,且以胶原蛋白为主[1]。已有研究表明,从海蜇中提取的胶原蛋白可用于治疗风湿性关节炎[1]。研究发现,低分子肽较氨基酸更易为人体所吸收,且具有某些特殊的生理功能,如可降低血液中的胆固醇、清除自由基、预防和治疗高血压、促进钙质吸收、增强机体免疫力、促进肉芽生长从而加速伤口愈合等[2]。来自海洋生物的活性肽尽管研发历史较短,但因其具有的独特生理功能而异军突起,成为活性肽领域的研究热点[3]。日本、欧美等国把海洋生物中功能肽系列产品的研究与开发作为发展海洋保健食品和药物的一个重要方向,并取得了丰硕的成果[4]。我国食用海蜇资源丰富,每年在海蜇的加工过程中都将出现大量的资源浪费,更严重的是直接导致环境的污染。近几年来,组合生物技术等高新技术的发展使具有生物功能的低分子活性肽的开发成为水产品高值化利用领域的研究热点。而且海蜇胶原蛋白在低抗原性、低过敏性、分子结构脆弱导致酶解较容易等方面具有一定的优势[5]。因此开发利用海蜇及其废弃物提取胶原蛋白,生产具有各种生理功能的活性肽具有广阔的应用前景。

2009-03-05 ＊通讯联系人

张绵松(1982-),男,硕士,研究方向：海洋食品生物技术。