反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯的合成及抗氧化活性的研究

吴亚凉,宁正祥

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯的合成及抗氧化活性的研究

吴亚凉,宁正祥

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

以浓硫酸为溶剂和催化剂,采用直接酯化法合成反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯(VC酯),对其反应条件进行优化,合成产率可达 53.45%,并采用羟基自由基体系、超氧阴离子自由基体系、二苯苦味肼基自由基体系对VC酯、VC的抗氧化活性进行了比较。结果表明:在一定的浓度范围内,两者对·OH、O-2·和 DPPH·均有清除作用,并呈一定的量效关系。VC酯对·OH、O-2·和 DPPH·的清除能力均优于VC,具有较好的自由基清除作用。

L-抗坏血酸,反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯,合成,抗氧化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-抗坏血酸、马来酸酐、甲醇、浓硫酸(98%)、乙酸乙酯、30%过氧化氢、水杨酸、无水乙醇、硫酸亚铁、Tris、邻苯三酚、盐酸 市售,国产分析纯试剂;二苯苦味肼基自由基 (DPPH·) Sigma公司,分析纯试剂;BHT 食品添加剂。

傅立叶变换红外光谱仪德国 burker公司;紫外可见光光度计(TU-1810PC) 北京普析通用仪器公司;旋转蒸发器 (RE-52) 上海雅荣生化设备仪器有限公司;循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;分光光度计 (721) 上海精密科学仪器有限公司;pH计(pH-25型) 上海雷磁仪器厂;JB-2型恒温磁力搅拌器 上海雷磁仪器厂新泾分厂;恒温振荡器(THZ-82) 金坛市富华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 富马酸单甲酯的制备 马来酸酐和精确等摩尔量的甲醇在密封环境中进行醇解反应生成马来酸单甲酯,然后在异构化催化剂无水三氯化铝存在的情况下异构化生成富马酸单甲酯。按张庆[3]等人的方法,将摩尔比为 1∶1的 19.60g马来酸酐和 6.40g甲醇加入装有冷凝管、搅拌器和温度计的 250mL干燥的三口圆底烧瓶中,加热至 45℃并搅拌至透明,然后升温至 60℃反应 2h。然后加入占体系 4%的氯化铝,在 80℃条件下异构化反应 2.5h。用 75℃蒸馏水重结晶、冷却、过滤,于真空干燥箱 55℃时干燥,得白色固体。

1.2.2 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯的合成 采用直接酯化法[4],向 20mL浓硫酸中缓慢加入摩尔比为 1∶3的富马酸单甲酯(0.015mol)和VC(0.045mol),室温下搅拌 1h,待 VC完全溶解后,放入恒温振荡器中,25～26℃下反应 28h。

反应结束后,将反应体系倒入快速搅拌的50g碎冰中,待冰块完全溶化后,用 50mL乙酸乙酯萃取,分出乙酸乙酯层。水层再用 50mL乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯层,用无水 Na2SO4干燥过夜,在0.1MPa下 33～35℃旋转蒸发,蒸发至重量不再改变,得淡黄色物质。

合成工艺路线如下:

以目标产物的得率为指标,优化影响合成反应产率的主要因素 (反应物配比、温度、时间),并对产物进行紫外及红外检测。

1.2.3 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯清除羟自由基 (·OH)活性研究[5]采用 Fenton反应。利用H2O2与 Fe2+混合产生·OH,在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质,该物质在 510nm处有最大吸收。向试管中依次加入 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水杨酸-乙醇 0.5mL、不同浓度的试样液4mL,最后加 8.8mmol/L H2O20.5mL启动反应,37℃反应 0.5h,在 510nm下测量各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值,以 9mmol/L FeSO40.5mL、9mmol/L水杨酸-乙醇 0.5mL、不同浓度样品 4mL和0.5mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。空白对照不加试样液,以蒸馏水补充体积。每个浓度做三个平行,取其平均值,同时与 VC、BHT比较清除能力。

式中:AO为空白对照液的吸光度;AX为加入样品溶液后的吸光度;AXD为不加显色剂 H2O2样品溶液本底的吸光度。

1.2.4 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯清除超氧阴离子(O2-·)活性研究[6]采用邻苯三酚自氧化法测定抗氧化性。取 0.05mol/L Tis-HCl缓冲液 (pH= 8.2)4.5mL,置于 25℃水浴中预热 20min,分别加入4.4mL各浓度试样和 0.1mL 25mmol/L邻苯三酚溶液(以 10mmol/L HCl配制),混匀后于 25℃水浴中反应5min,加 1mL 8mol/L HCl终止反应,于 299nm处测定吸光度。对照管不加邻苯三酚溶液,测其试样的本底吸收值。空白管不加试样溶液,用 4.4mL蒸馏水补充体积,每个浓度试样做三个平行,取其平均值,同时与 VC、BHT比较清除能力。

其中:AO、A1、A2分别代表空白、样品及其对照的吸光度。

1.2.5 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯清除DPPH·活性研究[7]准确称取 20mg DPPH,用无水乙醇定容于 250mL容量瓶中,得到浓度为 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液,在 0～4℃下避光保存。分别吸取不同浓度的样品的乙醇溶液 2mL,加入 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL,摇匀后,在室温,黑暗处放置30min。以无水乙醇调零,测定 517nm处的吸光值A1。同时,测定样品溶液 2.0mL与乙醇 2.0mL混合液在 517nm处的吸光值 A2,再测定 2.0mL DPPH溶液与 2.0mL乙醇在517nm处的吸光值A0。同一测定重复 3次,同时与 VC、BHT比较清除能力。

其中:AO、A1、A2分别代表空白、样品及其对照的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 产物性状及结构鉴定

产物为淡黄色固体,微溶于水,易溶于乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂,不溶于乙醚。

图 1 富马酸单甲酯、VC、产物的紫外扫描图谱

图1为产物的紫外可见吸收光谱图,曲线1为富马酸单甲酯的吸收光谱,其在 212nm处有强吸收峰,这是由于富马酸单甲酯含有碳碳共轭双键,曲线 2为VC的吸收光谱,VC具有环状结构,在 260nm附近有强吸收,曲线 3为产物的吸收光谱,经过纯化过的产物在这两波长附近仍具有强吸收峰,由此初步认定为目标产物。

图 2为产物的红外吸收光谱图,其特征吸收峰如下:酯类的特征吸收峰为位于1715cm-1的 C=O伸缩振动吸收带及 1174cm-1为 -C-O-C-吸收峰; 650cm-1为 =CH的吸收峰,1433cm-1为 CH2与 CH3的变形振动吸收蜂,1687cm-1为 C=C的吸收峰, 3084cm-1为产物分子中未参加反应的-OH的伸缩振动吸收带。结合产物的溶解特性,确认所得物质为产物。

图 2 产物的红外吸收光谱图

2.2 反应条件对反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯得率的影响

在L-抗坏血酸的四个羟基中,较易被酯化的是6-位的伯醇羟基,但若反应条件控制不当,L-抗坏血酸的其他的羟基也有可能被酯化,而本实验的目标产物是为L-抗坏血酸的 6-位有机酸酯。因此,为了避免副反应的发生,得到高产率的目标产物,必须对反应的物料比、温度及时间进行研究。

2.2.1 物料比对反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯得率的影响 本反应为可逆反应,增大某一反应原料的用量都有利于反应向正方向进行。VC价格低廉,所以采用VC过量。以 98%的硫酸为溶媒,VC与富马酸单甲酯不同摩尔比,在 25～26℃下,反应 28h,考察反应收率,结果如图 3。

图 3 物料配比对VC酯产率的影响

由图 3可以看出,当VC与富马酸单甲酯的摩尔比在 1.2～2.5范围内时,随着 VC用量的增加,反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯的产率随之提高,但再提高VC的比例,产率无明显提高趋势,因此,,考虑经济成本,为了获得高产率,VC与富马酸单甲酯的摩尔比为 3较为合适。

2.2.2 反应温度、时间对反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯得率的影响 酯化反应为可逆反应,只有在一定的温度条件下,才能逾越反应的活化能垒,向正方向反应,得到高产率。反应温度过低时,底物分子很难逾越反应的活化能垒,反应缓慢,反应时间较长,酯化产率低。反之,若反应温度过高,会造成较多的副反应,且VC的耐热性较差,高温下易氧化,因此反应温度也不能太高。

以 98%的硫酸为溶媒,VC与富马酸单甲酯的摩尔比为 3,考察反应温度、反应时间对产率的影响,结果如图4。

图 4 反应温度、时间对VC酯产率的影响

由图 4可以看出,当反应时间在 16～28h范围内,各温度下的酯化产率均随着反应时间的延长而提高,当反应时间为 28h,各温度的酯化产率均为最高,当反应时间从 28 h增加到 40h,产率下降,且产物的色泽变差。因此,反应的最佳时间为 28h。

温度不宜太过高也不宜太低,当反应时间为28h,反应温度为 25℃时,酯化产率达到最高,为53.45%;当反应温度高于 25℃,反应的选择性会降低,生成显著量的 5-位酯和 5,6-位二酯等副产物。此外,过高的温度会导致 VC被氧化,造成较多的副反应,使产率降低,且浓硫酸的炭化作用使产品色泽变差。因此,反应的最佳温度为 25℃。

2.3 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯抗氧化活性的研究

2.3.1 清除羟自由基(·OH)活性研究 根据 Fenton方法产生·OH自由基的模型[8],H2O2与亚铁离子反应生成·OH自由基,该反应为:H2O2+Fe2+→OH-+·OH+Fe3+,自由基一般存活时间比较短而且具有较高活性,而水杨酸能有效地捕捉·OH自由基且产生有色产物,该有色物质在 510nm处有最大的吸收,若向体系中加入自由基清除基,体系在最大吸收波长处吸收减弱,由此可以测算所加入的物质对自由基的清除率。I C50值表示清除 50%自由基时所需抗氧化剂的量,是衡量其抗氧化效果的有效指标。

由图 5可见,随着各试样液浓度的增加,各试样对羟基自由基的清除能力均呈上升趋势,清除率与浓度成量效关系。清除能力大小依次为:VC酯 > BHT>VC。VC酯、BHT、VC清除·OH的 I C50值分别为 0.14、0.17、0.31mg/mL。

由图 6可以看出,在所选质量浓度范围内,VC酯、BHT、VC清除·的 I C50值分别为 0.21、0.24、 0 1 2 9 m g／m L，且清除率随着浓度的增大而增大。特别是当VC酯的质量浓度达到 0.11mg/mL后,其清除·能力优于 BHT。这说明,VC酯对·有良好的清除作用。

图5 VC、VC酯、BHT对·OH的清除能力

图 6 VC、VC酯、BHT对O-2·的清除能力

2.3.3 清除 DPPH·活性研究 二苯苦味肼基(DPPH·)是一种稳定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,在可见光区 517nm处有最大吸收峰。当向含有DPPH·的溶液体系加入自由基清除剂时,其中的孤电子被配对形成另一稳定的化合物,溶液颜色由深变浅,反应体系在 517nm处的吸光度值将变小,吸光度值变小的程度与自由基被清除程度呈定量关系[9],据此可检测自由基被消除的情况,实验结果如图 7所示。

图 7 VC、VC酯、BHT对DPPH·的清除能力

由图7可见,各试样对自由基均具有清除DPPH·作用,清除能力大小依次为:VC酯 >BHT>VC。各试样在一定浓度范围内,清除能力与浓度成量效关系,且各试样均表现了相似的变化趋势,即达到最大清除率后,清除率将不再随浓度的增加而增强。VC酯、BHT、VC清 除 DPPH·的 I C50值分别为 0.20、0.30、0.49mg/mL。

3 结论

3.1 采用直接酯化法,以 L-抗坏血酸、马来酸酐为原料,浓硫酸作为催化剂及溶剂,合成反丁烯二酸-6 -L-抗坏血酸甲酯。其最优反应条件为 VC与富马酸单甲酯的摩尔比为 3,反应温度为 25℃,反应时间为 28h,在此反应条件下,产率高达 53.45%。

3.2 反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯的抗氧化性能表明,其对·OH、O-2·和DPPH·均具有良好的清除作用,在一定浓度范围内,其清除效果与 VC酯浓度成正相关,且其清除效果优于VC,清除·OH、O-2·和DPPH·的 I C50值分别为 0.14、0.21、0.20mg/mL,是一种良好的抗氧化剂。本文通过对 VC进行化学改性,扩展了其在应用过程的稳定性,为开发新的VC衍生物提供了依据。

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Synthesis of 6-L-ascorbyl trans-β-alkoxycarbonylacrylate and study on its antioxidant property

W U Ya-liang,NING Zheng-xiang
(College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was p rep a red via es te rifica tion by H2SO4as the solvent and ca ta lys.The reac tion cond itions was op t im ized and 53.45% yie ld could be ob ta ined unde r the op t im um synthes is cond ition.The antioxida tive ac tivities of ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te was comp a red through the sup e roxide anion free rad ica l sys tem,hyd roxyl rad ica l sys tem and sys tem ofDPPH·. D iffe rent scaveng ing effec t be tween ascorb ic ac id and6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te in these rad ica lsys tem s wasobse rved,bes ides the antioxide tive ac tivitiesbecom e s tronge r w ith the inc rease of the concentra tion.The scaveng ing cap ab ility of6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te to sup e roxide anion free rad ica l,hyd roxyl rad ica l and DPPH· wass tronge r than tha t of ascorb ic ac id.6-L-ascorbyl trans-βa lkoxyca rbonylac ryla te was found w ith s ignificant scaveng ing effec t.

ascorb ic ac id;6-L-ascorbyl trans-β-a lkoxyca rbonylac ryla te;synthes is;antioxidant ac tivity

TS202.3

A

1002-0306(2010)01-0310-04

L-抗坏血酸是一种水溶性的维生素,也是一种维持人体正常生理活动所必需的营养强化剂,同时还作为一种安全高效的抗氧化剂广泛用于食品工业,然而 L-抗坏血酸有稳定性不佳、脂溶性较差等缺点。由于VC分子中有烯二醇基团,具有较强的还原能力,因此极易被氧化为去氢抗坏血酸,尤其是在空气、光线、热和金属离子的存在下,VC的功效极易减弱甚至消失[1]。VC的不稳定性使其应用受到限制,因此,对VC进行改性,增强其稳定性进而扩展其应用范围,是目前世界上许多公司和学者所关注的热点。目前已被开发的抗坏血酸及其衍生物主要有抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸硬脂酸酯等[2],主要被德国巴斯夫公司、日本武田公司、SIG MA公司等几家大公司所垄断。本实验以 L-抗坏血酸和马来酸酐为主要原料,浓硫酸为溶剂及催化剂,采用直接酯化法对L-抗坏血酸进行分子修饰,对其反应条件 (如物料配比、反应时间、反应温度)进行优化,合成了一种新的 VC衍生物——反丁烯二酸-6-L-抗坏血酸甲酯,提高了 VC的稳定性,并对其对·OH、O-2·和DPPH·自由基的清除能力进行研究。

2009-03-30

吴亚凉(1985-),女,硕士,研究方向:食品化学。