应用二次回归正交旋转组合设计优化中国毛虾蒸煮液酶解工艺的研究

张 井，李 燕，徐 静，*，薛长湖

（1.温州市农业科学研究院食品科学研究所，浙江温州325006；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

应用二次回归正交旋转组合设计优化中国毛虾蒸煮液酶解工艺的研究

张 井1，李 燕1，徐 静1，*，薛长湖2

（1.温州市农业科学研究院食品科学研究所，浙江温州325006；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

以蛋白水解度为指标，在中国毛虾蒸煮液单因素酶解研究的基础上，采用二次回归正交旋转组合设计对其酶解工艺进行优化。建立了蛋白水解度与酶解初始pH、酶解时间及蛋白酶用量三个实验因素的正交回归模型方程，根据回归模型进行主效应分析，通过频率分析法得到了酶解最佳工艺条件：酶解初始pH为7.6，酶解时间为8h，蛋白酶用量为0.51%（w/w），最佳条件下的水解度为38.8%。

中国毛虾蒸煮液，二次回归正交旋转组合设计，酶解

表1 二次回归正交旋转组合设计因子水平编码表

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国毛虾蒸煮液 浙江省瑞安市华盛水产品加工厂提供，以冷冻方式运到实验室，贮藏于-40℃冰箱备用；动物蛋白水解复合酶 酶活力60万U/g，购于广西南宁庞博生物工程有限公司；其它试剂 均为国产分析纯。

电子分析天平 北京奥多利天平有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；METTLER TOLEDO DELTA320 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Anke GL-20G-II高速冷冻离心机。

1.2 酶解工艺

毛虾蒸煮液解冻→低温减压浓缩→调节酶解初始pH→加动物蛋白水解复合酶→恒温搅拌（50℃，300r/min）→灭酶（100℃，10min）→冷却→离心（5000r/min，10min）→取上清液→测定清液中氨基酸态氮和总氮含量

1.3 分析测定方法

1.3.1 氨基酸态氮的测定 甲醛滴定法［6］。

1.3.2 总氮的测定 半微量凯氏定氮法［6］。

1.3.3 水解度（DH）测定 DH=离心液中氨基酸态氮含量/离心液中总氮含量

1.4 酶解单因素实验

1.4.1 酶解初始pH对水解度的影响 酶解初始pH分别控制为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，酶解时间8h，蛋白酶用量（以酶/底物的质量 ×100% 计，以下同）0.50%。

1.4.2 酶解时间对水解度的影响 酶解时间分别控制为4、6、8、10、12h，酶解初始 pH7.0，蛋白酶用量0.50%。

1.4.3 蛋白酶用量对水解度的影响 蛋白酶用量分别控制为0.25%、0.50%、0.75%、1.0%，酶解初始pH7.0，酶解时间8h。

1.5 二次回归正交旋转组合设计优化酶解工艺

1.5.1 因素水平的确定 酶解的效果受到很多因素的影响，而且各个因素之间往往又存在交互作用，所以很难建立一个适应面广泛的理论模型来反映酶解的全过程。针对传统单因素实验设计具有的明显不足，在此采用二次回归正交旋转组合设计对酶解工艺的主要影响因素进行实验优化。主要影响因素及其对应的零水平值，根据预先单因素实验结果确定。

1.5.2 参数设计 变量参数 p=3；星号臂值 r= 1.682；±1水平的因子点实验全部实施为mc=2p=8；±r水平的星号臂点为mr=2p=6；为了使得二次旋转组合设计具有正交性，各因素是零水平的中心点为m0=9；总实验点n=mc+mr+m0=23。因子水平编码见表1。

2 结果与分析

2.1 酶解单因素实验结果

2.1.1 酶解初始pH对水解度的影响 通常情况下，每种酶都有一个最适的pH，显著的酶活性只发生在非常窄的pH范围内，因为蛋白酶和底物蛋白质均有解离基团，只有这些解离基团处于特定的解离状态时，酶分子与底物蛋白分子才会结合得快，生成产物的速度最快［7］。由图1可知，随着初始pH的增加，水解度迅速增加，当初始pH超过7.0时，水解度随之下降。因此，酶解初始pH选择在6.0～8.0之间较为合适。

图1 初始pH对水解度的影响

2.1.2 酶解时间对水解度的影响 酶解时间的长短主要影响一定条件下酶解反应进行的程度。由图2可知，反应开始时水解度增加趋势较陡，当反应时间到达8h时，增加趋势开始变缓。这可能是因为酶的催化速度会受到产物的影响，反应初期，产物的抑制作用小，随着时间的延长，酶活力逐渐下降，游离的小肽和氨基酸增多，产物的抑制作用增加。因此，酶解时间选择在6～10h之间较为合适。

图2 酶解时间对水解度的影响

2.1.3 蛋白酶用量对水解度的影响 由图3可见，不加蛋白酶时，由于底物中少量内源性蛋白酶的作用，蛋白质有所水解，但水解度不高。随着外加蛋白酶浓度的增加，水解度也在缓慢增高，在实际操作中，不可能无限制地增加酶的浓度，且当蛋白酶浓度过大时，容易发生自水解，反而干扰了酶解物的组成。因此，蛋白酶用量选择在0.4%～0.6%之间较为合适。

2.2 毛虾蒸煮液酶解工艺的优化

图3 酶用量对水解度的影响

2.2.1 数学模型方程的建立 实验结果见表2，采用DPS数据处理系统［5］对实验数据进行拟合，得到回归方程如下：

结合方差分析（见表3），在!=0.10显著水平下剔除不显著项，简化后的回归方程为

表2 二次回归正交旋转组合设计及实验结果

2.2.2 二次回归模型的显著性检验 为检验回归方程的有效性，按F1=失拟均方/误差均方，F2=回归均方/剩余均方的程序进行检验。由表3可知，失拟项的F值为1.86705，P＞0.05，说明失拟检验不显著，所采用的回归模型适应于本反应性状的分析。二次回归模型的F值为7.88478，P＜0.01，说明模型的拟合极显著，所建立的方程能够较好地表达水解度与酶解初始pH、酶解时间及蛋白酶用量三个因素之间的关系。

由表3还可知，线性项X2未达到显著水平，平方项未达到显著水平，交互项X1X2、X1X3、X2X3未达到显著水平，因此不需要做交互作用分析，以下仅对影响显著的因素进行效应分析。

表3 实验结果方差分析表

2.2.3 主要因素效应分析 由于本实验设计满足了正交设计的要求（一次项按正交表设计，二次项施行了中心化线性变换），因而模型中各项效应可以线性相加，偏回归系数间彼此独立，故可采用“降维法”分析，即固定任意两个因子于某一水平，考察另一因子取不同值时产量的变化规律，这恰好相当于特定条件下所做的一组单因素实验模型。本处理中将任意两个因素固定在零水平，从而得到另一个因素与水解度之间的效应方程，经处理后，得到的方程依次为：

由主效应方程可以做出各因素与水解度的关系图（见图4）。由图4可知，在-1.682≤Xi≤1.682的范围内，酶解初始pH及蛋白酶用量与水解度之间接近线性关系，表明这两个因素对水解度的影响较显著，在一定范围内，随着酶解初始pH及蛋白酶用量的增加，水解度也在提高。在整个水平范围内，酶解时间与水解度的之间接近呈水平线性关系，表明酶解时间对水解度无显著影响。

图4 实验因子的主效应分析

2.2.4 最佳酶解方案 寻求模型的最优解，就是模型方程在约束条件r：-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）内的非线性规划问题。用频率分析法［5］解析，在-1.682≤Xi≤1.682区间，取步长为1，经分析，其中水解度高于34.21%的方案有65个，见表4。

由表4可知，在95%分布区间内，水解度高于34.21%的酶解方案为：酶解初始pH7.49～7.70，酶解时间7.64～8.36h，蛋白酶用量0.49%～0.53%。为实际操作方便起见，取最优方案区间的平均值为最优酶解条件，即：酶解初始pH为7.6，酶解时间为8h，蛋白酶用量为0.51%。经验证，此时蛋白水解度为38.8%。

表4 优化方案中各变量取值频率分析

3 结论

3.1 通过单因素实验和二次回归正交旋转组合设计实验研究，得到了中国毛虾蒸煮液酶解的最佳方案：酶解初始pH为7.6，酶解时间为8h，蛋白酶用量为0.51%（w/w）。在最佳酶解条件下，中国毛虾蒸煮液中蛋白质的水解度为38.8%。

3.2 建立了蛋白水解度（Y）与酶解初始pH（X1）、酶解时间（X2）及蛋白酶用量（X3）三个实验因素的正交回归模型方程：

Y=34.85711+1.83257X1-0.03595X2+0.83541X3-0.06250X1X3-0.28750X2X3，通过该方程可以对中国毛虾蒸煮液中蛋白的水解程度进行较好地预测，对实际生产有一定的指导意义。

［1］章超桦，曹文红，湛素华，等.中国毛虾营养成分分析与评价［J］.福建水产，2001（1）：8-14.

［2］FAO/WHO.Energy and Protein Requirement.Rome：Food and Agricultural Organization of the United Nations，1973.

［3］付雪艳，薛长湖，宁岩，等.中国毛虾酶解多肽降压作用的初步探讨［J］.海洋科学，2005，29（3）：20-24.

［4］章超桦，曹文红，吉宏武，等.中国毛虾ACE抑制肽的初步研究［J］.水产学报，2005，29（1）：97-102.

［5］唐启义，冯光明.实用统计分析及其计算机处理平台［M］.北京：中国农业出版社，1997：77-91.

［6］大连轻工业学院.食品分析［M］.北京：中国轻工业出版社，1990.

［7］赵梅，吴成业.罗非鱼下脚料酶解工艺的响应面法优化［J］.食品研究与开发，2007，28（1）：8-14.

Study on optimization of enzymatic hydrolysis of cooking juice of Acetes Chinensis through quadratic regression orthogonal rotational combinational design

ZHANG Jing1，LI Yan1，XU Jing1，*，XUE Chang-hu2
（1.Institute of Food Science，Wenzhou Academy of Agricultural Sciences，Wenzhou 325006，China 2.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Using the degree of hydrolysis as target，based on the single factor studied on the enzymatic hydrolysis conditions of cooking juice of Acetes Chinensis，the enzymatic hydrolysis conditions of cooking juice of Acetes Chinensis were optimized through quadratic regression orthogonal rotational combinational design.The quadratic regression model was of degree of hydrolysis to three factors of initial pH value，time and the concentration of enzyme.The best enzymatic hydrolysis conditions were analyzed and the results were as follows：initial pH value 7.6，time 8h，enzyme concentration 0.51%（w/w）.The degree of hydrolysis was 38.8%under above conditions.

cooking juice of Acetes Chinensis；quadratic regression orthogonal rotational combinational design；enzymatic hydrolysis

TS254.1

A

1002-0306（2010）07-0167-04

中国毛虾（Acetes chinensis），又名虾米，其蛋白质含量高达72.9%（干基），必需氨基酸齐全，符合FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式，其独特的氨基酸结构使其在呈味、营养保健方面均具有较大的开发利用价值［1-4］。毛虾蒸煮液是毛虾加工成冷冻品或干制品过程中产生的副产物，每加工1t毛虾产品，就会产生1.5t左右蒸煮液。由于蒸煮液中含有大量蛋白质、多糖等营养物质，如果直接排入水体易引起水质富营养化，对环境的污染极为严重。所以，以低值的中国毛虾蒸煮液生产高附加值的虾味海鲜调味料，特别是海洋功能性保健食品，既可充分利用废弃资源，又可减少对环境的污染，不失为一种较好的开发利用途径。二次回归正交旋转组合设计是正交回归实验设计的一种，它既能分析各处理因子的影响，又能建立定量的数学模型，属更高级的实验设计技术［5］。动物蛋白水解复合酶主要由蛋白内切酶、外切酶和风味酶组成，其作用原理是通过内切酶切断多肽内部的肽键，通过外切酶每次从多肽链的末端释放一个氨基酸，而风味酶则对水解的苦味和风味起着优化作用。本文首先对动物蛋白水解复合酶酶解作用的初始pH、酶解时间及酶用量三个酶解条件进行单因素考察，在此基础上，采用二次回归正交旋转设计法对酶解工艺进行系统优化，通过频率分析法得到最佳酶解条件，以期为中国毛虾蒸煮液的深入开发利用提供一定的技术参考和理论依据。

2009-08-27 *通讯联系人

张井（1984-），男，硕士，主要从事水产品加工及综合利用研究。

国家863高技术研究发展计划项目（2007AA091801）；浙江省科技厅重大科技专项农业项目资助（2007C12065）。