五倍子抑菌物质的提取及其抑菌作用的研究

张 霞，孙宝忠，哈斯格根，艾启俊，*，李 洋，康 丽，杨艾青（.北京农学院食品科学系，北京006；

2.中国农业科学院，北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

五倍子抑菌物质的提取及其抑菌作用的研究

张 霞1，孙宝忠2，哈斯格根3，艾启俊1，*，李 洋1，康 丽1，杨艾青1（1.北京农学院食品科学系，北京102206；

2.中国农业科学院，北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

采用L16（44）正交设计实验，对五倍子抑菌物质的提取工艺进行研究。从五倍子提取液的光谱特性入手，选定料液比、浸提时间、浸提温度、浸提功率四个工艺因素，先进行单因素实验，然后进行四因素四水平正交实验，确定最佳工艺条件为：料液比1∶10，提取时间60min，提取温度70℃，提取功率35kHz。50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相当于2.5mg/mL的青霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。从生长曲线的绘制看来，高浓度的提取液都在菌体对数生长期进行抑制，达到抑菌效果。

五倍子，抑菌物质，提取工艺，抑菌作用

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五倍子 购于北京市回龙观大药房；大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由北京农学院食品系微生物实验室提供；牛肉膏蛋白胨培养基 LB培养基［6］。

YX-280手提式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备厂；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司提供；Blue pard GHP-9160隔水式恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；7520型紫外可见分光光度计 上海第三分析仪器厂；氢氧化钠，盐酸，pH试纸，6mm直径的牛津杯，游标卡尺等。

1.2 实验方法

1.2.1 光谱特征研究 由于五倍子提取物的抑菌成分是多种成分组合在一起，必须对其进行光谱特征研究。取五倍子水提液适量，稀释定容，用7520可见分光光度计扫描，确定最高吸收峰，为正交实验确定最佳提取工艺条件做准备［7］。

1.2.2 五倍子抑菌物质提取工艺研究

1.2.2.1 单因素对提取效果的影响 根据应用对象为食品，从安全出发，研究料液比（A）、浸提时间（B）、浸提温度（C）、超声波频率（D）等因素对提取效果的影响，筛选最佳提取工艺。

1.2.2.2 复合因素对提取效果的影响 选用L16（44）正交表进行正交实验，因素水平见表1。

表1 实验因素水平表

将五倍子药材研磨成粉末状，准确称取2.0g五倍子粉末，放入具塞三角瓶中，按单因素和L16（44）正交表进行提取，过滤得滤液，滤渣重新提取一次，将两次滤液合并，取适量稀释定容，在7520可见分光光度计上最大吸收波长处测OD值。

1.2.3 五倍子浸提液抑菌效果的研究

1.2.3.1 五倍子最小抑菌浓度（MIC）的测定［8］用LB液体培养基将五倍子提取物稀释成含生药100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的药基，对照为LB液体培养基。取对数生长期的测试菌中分别加入到药基中，使每毫升药基含菌体105个，将各试管放入摇床中培养（37℃，130r/min）。24h后取出培养物划线于LB琼脂培养基上，平皿置于37℃恒温箱中继续培养，24h后取出观察，平皿上的菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

1.2.3.2 五倍子浸提液对测试菌生长曲线的影响［9］

取五倍子浸提液，稀释，依次配制成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的溶液，放入试管中，依次标号为1、2、3、4、5、6、7。另取两只试管，一支加入空白液体培养基，作为阴性对照，标号为8；另一只加入青霉素作为阳性对照，标号为9。在九支试管中加入等量的金黄色葡萄球菌，混合均匀。

取九支试管，分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的五倍子浸提液，青霉素和液体培养基，加入等量的大肠杆菌，混合均匀。

将上述配制好的18支试管都放入恒温振荡器中，培养24h，取出后在分光光度计上测定其OD值。培养液OD值与培养液内细菌繁殖速度呈正相关，OD值升高越快，表示培养液内细菌浓度越高。培养液由于加入了五倍子浸提物中的抑菌成分，起到抑菌作用，故可抑制培养液OD值上升。

1.2.3.3 不同浓度五倍子浸提液与青霉素抑菌效果的研究 取7只试管，除第一支以外均加入10mL生理盐水，在第一支试管中加入20mL五倍子浸提液，取10mL加入第二支试管中，振荡使第二支试管中的液体混合均匀。从第二支试管中取出10mL加入到第三支试管中，依次类推，直到稀释到第七支试管，将第七支试管混合均匀后从中吸取10mL液体倒掉。至此已将五倍子浸提液浓度稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56mg/mL。

再取6支试管，除了第一支外均加入10mL生理盐水，第一支试管中加入青霉素溶液20mL，从中吸取10mL加入到第二支试管中，将第二支混合均匀后吸取10mL加入到第三支试管中，以此类推，到第六支试管，将第六支试管混合均匀后吸取10mL倒掉。至此已将青霉素的浓度稀释至40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL六个梯度。

取26个灭菌培养皿，倒入适量融化并冷却的牛肉膏蛋白胨培养基，在13个皿中注入一定量的大肠杆菌，在另13个培养皿中注入等量的金黄色葡萄球菌，在酒精灯下涂布，使细菌分布均匀。每个培养基中等距离放入三个已灭菌的牛津杯，将上述配制好的不同浓度的五倍子浸提液和青霉素溶液注入到牛津杯中，上述操作应该在灭菌的条件下进行。

完成上述过程后，将26个培养皿放到培养箱中，在37℃条件下，培养24h，取出后用十字交叉法测量其牛津杯周围抑菌圈直径大小。

2 结果与分析

2.1 五倍子提取物的光谱特性

在可见分光光度计下的光谱特性结果见图1。

图1 五倍子水提液最大吸收波长的初步测定

由图1可见，五倍子提取液在350～360nm之间出现了最大的吸收峰，可以初步确定五倍子的最大吸收波长在350～360nm之间。继续做精确测定，结果见图2。

从图2可以清晰地看出，五倍子浸提液的最高吸收峰为358nm，其吸光度值为0.578。测出的吸收峰与《现代中草药成分化学》［10］中介绍的五倍子最高吸收峰（360±2nm）有差距，但差距不大。因此确定358nm为本实验中五倍子提取液的最大吸收波长，为后续工艺实验做准备。

2.2 五倍子抑菌物提取工艺的确定

2.2.1 单因素实验结果

图2 五倍子水提取液最大吸收波长精确测定

2.2.1.1 料液比 在浸提温度为70℃，浸提时间为30min，超声波频率为25kHz下进行浸提，结果见图3。

图3 不同料液比的提取结果

由图3可知，随料液比逐渐减少，提取效果先增加后减小，在1∶15的料液比时，提取效果最好。

2.2.1.2 浸提时间 在浸提温度70℃，超声波频率为25kHz，料液比1∶25下进行浸提，结果见图4。

图4 不同浸提时间的提取结果

从图4可以看出，随时间增加，提取效果逐渐增加，但并不是浸提时间越长越好，当提取时间超过50min后，增加趋势减弱，故以50min效果较佳。

2.2.1.3 浸提温度 在料液比1∶25，浸提时间60min，超声波频率为25kHz条件下进行浸提，结果见图5。

图5 不同浸提温度的提取结果

由图5可知，随温度升高，提取效果逐渐增加，但当温度大于70℃后，提取效果降低，故选70℃为最佳提取温度。

2.2.1.4 超声波频率 在浸提温度为70℃，浸提时间30min，料液比1∶15下进行浸提，结果见图6。

图6 不同提取功率的提取结果

从图6可以看出，超声频率在30kHz内，OD值随时间的延长而增大，以30kHz为最佳；超过30kHz后，OD值呈下降趋势。

2.2.2 正交实验结果 按L16（44）正交表进行正交实验，结果见表2。

表2 L16（44）的正交实验结果与分析

采用SAS13.0 windows数据处理软件进行数据处理，方差分析见表3。

表3 方差分析表

从表2、表3的实验结果可知，采用超声波辅助水浴加热，各因素对提取五倍子中抑菌成分都存在着显著影响，其影响程度排列顺序为A＞C＞D＞B。综合分析最佳组合为A1B4C3D3，即料液比为1∶10，提取时间为 60min，提取温度为 70℃，提取功率为35kHz，但由于在正交实验中没有此组合，所以进行验证实验，结果得其吸光值为0.792。

2.3 五倍子提取液对测试菌生长曲线抑制的研究结果

由图7可以看出，随提取液浓度的降低，抑菌效果也随之降低。且大肠杆菌在培养前11h内呈明显上升趋势，加有100～25mg/mL提取液的试管内的菌体浓度还出现了增长峰。说明提取液在12.5mg/mL浓度以上对大肠杆菌对数期的增长有明显抑制作用。但与CK-（青霉素溶液）的抑菌效果还有一定差距。

图7 五倍子对大肠杆菌生长曲线的影响

由图8可以看出，金黄色葡萄球菌的浓度在培养前10h呈明显上升趋势，但随后趋于稳定，在14h其OD值达到最大值，以后维持稳定状态。五倍子提取液浓度越高，抑菌效果越明显，浸提液浓度为100mg/mL时抑菌效果最好。随着五倍子浸提液浓度的下降，试管中金黄色葡萄球菌的OD值逐渐增加，说明金黄色葡萄球菌的浓度在逐渐增加，五倍子浸提液对金黄色葡萄球菌的抑制作用在逐渐减小。同时与青霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用相比，青霉素溶液的抑菌效果是很明显的，金黄色葡萄球菌的浓度一直很低。只加液体培养基的试管其金黄色葡萄球菌在前15h之内，快速生长繁殖，其OD值达到了0.910。

图8 五倍子对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

2.4 五倍子提取液的抑菌效果

2.4.1 平板法测定抑菌效果 结果表明，五倍子提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌作用（见表4）。

表4 五倍子提取液的最小抑菌浓度（MIC）

从表4可知，五倍子浸提液对大肠杆菌最低抑菌浓度为12.5mg/mL，而对金黄色葡萄球菌的效果更好，最低抑菌浓度为6.25mg/mL。

2.4.2 不同浓度的五倍子浸提物与青霉素抑菌效果的比较 从表5可以得出，随着五倍子提取液浓度的下降，抑菌作用也随之下降。从表6可以看出，随着青霉素浓度的下降，抑菌作用也随之下降。两表相比较可以看出，50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相当于2.5mg/mL的青霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

表5 不同浓度五倍子浸提物的抑菌效果

表6 不同浓度青霉素的抑菌效果

3 结论与讨论

3.1 五倍子天然抗菌物质的提取采用超声辅助水提取法，4个因素对五倍子抑菌活性物质提取效果的影响大小顺序为：料液比＞提取温度＞超声波提取频率＞提取时间。最佳提取工艺条件为：料液比为1∶10，提取时间为60min，提取温度为70℃，提取功率为35kHz。

3.2 五倍子提取液中的抑菌成分对供试的两种细菌均具有明显的抑菌作用，最小抑菌浓度分别为：对大肠杆菌12.5mg/mL；对金黄色葡萄球菌6.25mg/mL。

3.3 通过抑菌效果对比实验，证明50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相当于2.5mg/mL的青霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

3.4 五倍子提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。从绘制的生长曲线看来，高浓度的提取液都在菌体对数生长期进行抑制，达到抑菌效果。

［1］姜创，吴相，刘军海.超声辅助法提取五倍子中单宁酸的工艺研究［J］.食品与发酵科技，2009，45（2）：11-13.

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Study on ultrasonic-assisted extraction technology and antimicrobial activity of gallnut water extract

ZHANG Xia1，SUN Bao-zhong2，HASI Gegen3，AI Qi-jun1，*，LI Yang1，KANG Li1，YANG Ai-qing1
（1.Department of Food Science，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Zootechnics and Veterinary Science，China Academy of Agricultural Science，Beijing 100193，China；3.Food Science and Engineering Department，Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010018，China）

The L16（44）orthogonal design experiments were used to research gaIInut antibacterial substances on extraction process.Extracts from the gaIInut start the spectral properties of selected materials ratio，extraction time，extraction temperature，extraction power of the four process factors.To determine the optimum process conditions，single-factor test first and then proceed to four-level orthogonal experimental factors.The optimum conditions for the extracts were materials ratio to 1∶10，extraction time 60min，extraction temperature 70℃，extraction power 35kHz.The antibiotic effect of 50mg/mL of gallnut extract equivalent to 2.5mg/mL of the antibiotic effect of penicillin on Escherichia coIi and StaphyIococcus aureus.From the growth curve，the high concentrations of extract inhibit bacteria in the logarithmic phase.

gaIInut；antibacterial substances；extraction process；antibiotic

TS201.2

B

1002-0306（2010）07-0290-05

五倍子（Galla Chinensis），又称文蛤、百虫仓、木附子，是由五倍子蚜虫Melaphis chinensis（Bell）Baker寄生在漆树科植物盐肤木（Rhus chinensis Mill.）、青麸杨（Rhus potaninii Maxim）或红麸杨（Rhus punjabensis Stew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.）叶上形成的虫瘿［1］。五倍子的主要化学成分［2］是鞣质类，如五倍子鞣质、缩合没食子鞣质等；还含有脂肪、树脂、蜡质、乌氨酸等，这些化学成分具有较强的抑菌作用。据报道：五倍子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、链球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌等均有明显的抑菌或杀菌作用［3-5］。本实验从五倍子提取液的光谱特性入手，借助于超声波提取技术，选定料液比、浸提时间、浸提温度、浸提功率四个工艺因素，先进行单因素实验，然后进行四因素四水平正交实验，确定最佳工艺条件，通过与青霉素对照，研究五倍子提取液的抑菌作用。

2009-07-07 *通讯联系人

张霞（1985-），女，硕士研究生，研究方向：农产品安全与控制。

国家科技支撑计划项目（2006BAD05A17）。