促进酵母菌乙醇发酵新方法

惠丰立，褚学英，柯 涛，张彩莹

(南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061)

促进酵母菌乙醇发酵新方法

惠丰立，褚学英，柯 涛，张彩莹

(南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061)

在发酵培养基中添加固态基质，研究不同固态基质对酵母菌乙醇发酵的促进作用。结果表明：在培养基中分别添加2g/100mL的麦秸杆、花生壳、稻壳和锯末，可使发酵液中乙醇质量浓度提高了15.5%～24.8%。在4种不同固态基质中，稻壳对酵母菌乙醇发酵的促进作用最显著。以稻壳作为固态基质，确定了添加固态基质条件下酵母菌乙醇发酵的最适条件为：稻壳2.5g/100mL、初糖12g/100mL、温度30℃、发酵时间48h。在适宜的发酵条件下，发酵液中乙醇质量浓度可达到51.8g/L，为理论产率的92.7%。

酵母菌；乙醇发酵；固态基质；稻壳

以生物质资源为原料，发酵法生产的燃料乙醇作为可再生清洁能源，对于缓解当前石油资源严重短缺及生态环境恶化的双重危机具有十分重要的意义。然而，现有的乙醇发酵生产技术中，原料的转化率和产物的得率都较低，高昂的生产成本严重制约了燃料乙醇工业的发展[1-2]。因此，对传统乙醇发酵工艺进行改造，开发低成本乙醇生产新技术，以适应燃料乙醇产业发展的需要显得尤为迫切。

近年来，高转化率、低成本的乙醇发酵新技术已受到国内外有关研究者的关注。现已证实在培养基中添加脂蛋白[3]、几丁质[4]、肌醇[1]、营养盐[5]、氮类营养物[6-8]、渗透压保护剂[9]、吐温-80和麦角甾醇[10]，采用工程菌株[11]、固定化细胞[12-13]等方法，能不同程度的提高原料转化率和产物的得率，但这些方法在一定程度上又增加了生产成本。通过实验发现既能提高乙醇的产量又能降低生产成本的添加物中，固态基质更加具有可行性。本实验以廉价的农林废弃物作为酵母菌乙醇发酵的固态基质，探讨不同固态基质对酵母菌乙醇发酵的影响，建立一种高转化率、低成本的乙醇发酵新方法，为促进燃料乙醇产业的快速发展，缓解当前石油资源严重短缺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)dqy-1由本实验室分离保存。

1.1.2 培养基

斜面培养基(g/100mL)：葡萄糖2、酵母粉0.3、蛋白胨0.5、琼脂粉1.5；种子培养基(g/100mL)：葡萄糖2、酵母粉0.3、蛋白胨0.5；发酵培养基(g/100mL)：葡萄糖6～14、酵母粉0.3、蛋白胨0.5。

1.1.3 固态基质

选用麦秸杆、花生壳、稻壳和锯末，颗粒大小如稻壳。

1.1.4 仪器与设备

HMY200型全温度恒温培养摇床、ZSD-1160型生化培养箱 上海智诚公司；HM-12P型pH计 上海雷磁仪器厂；UNIVERSAL 320R型台式冷冻离心机 德国Hettich公司；SBA-40 C型生物传感分析仪 山东省生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 种子制备

从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接入种子培养基中(装液量50mL)，置于摇床上在28℃、160r/min振荡培养18～24h。

1.2.2 发酵方法

按体积分数10%的接种量将种子液接入发酵培养基中(装液量为100mL)，置于培养箱中28℃发酵40h(在对发酵条件进行优化时，根据具体情况设定)。

1.2.3 分析方法

乙醇及葡萄糖含量的测定均采用SBA-40 C型生物传感分析仪。

1.3 数据统计与分析

数据分析采用Microsoft Excel 2003进行统计分析，所有实验均做3个重复。

2 结果与分析

2.1 不同固态基质对酵母菌乙醇发酵的影响

在发酵培养基中分别添加2g/100mL的麦秸杆、花生壳、稻壳和锯末，发酵40h后，测定发酵液中乙醇质量浓度，结果见表1。

表1 不同固态基质对乙醇发酵的影响Table 1 Effect of solid matrix type on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由表1可知，在培养基中分别添加4种不同的固态基质，发酵液中乙醇质量浓度提高了15.5%～24.8%。其中添加稻壳的发酵液中乙醇质量浓度最高，比未添加固体基质的发酵液提高了24.8%。这说明在培养基中添加不同的固态基质对酵母菌乙醇发酵均有明显的促进作用。在4种不同的固态基质中，稻壳是最适宜的添加物。

2.2 固态基质不同添加量对酵母菌乙醇发酵的影响

以稻壳为固态基质，研究其不同添加量对酵母菌乙醇发酵的影响，结果如表2所示。在培养基中分别添加1～3g/100mL的稻壳，发酵液中乙醇质量浓度均有不同程度提高，其中添加2.5g/100mL稻壳的发酵液中乙醇质量浓度比未添加稻壳的发酵液增加了27.9%。由此可以确定稻壳的最适添加量为2.5g/100mL。

表2 固态基质(稻壳)不同添加量对乙醇发酵的影响Table 2 Effect of rice hull amount on ethanol fermentation by S. cerevisiae

2.3 不同初糖质量浓度条件下固态基质对酵母菌乙醇发酵的影响

为研究不同初糖质量浓度条件下固体基质对酵母菌乙醇发酵的影响，在含有6～14g/100mL初糖质量浓度的培养基中分别添加2.5g/100mL稻壳，结果如图1所示。

图1 初糖质量浓度对乙醇发酵的影响Fig.1 Effect of initial glucose concentration on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由图1可知，在培养基中添加固态基质均能提高乙醇质量浓度。当培养基中初糖质量浓度为12g/100mL时，发酵液中乙醇质量浓度达到了最大值，比对照提高了24.8%。

2.4 不同温度条件下固态基质对酵母菌乙醇发酵的影响在发酵培养基添加2.5g/100mL稻壳，将初糖质量浓度调到12g/100mL，研究不同温度条件下固态基质对酵母菌乙醇发酵的影响，实验结果见图2。

图2 温度对乙醇发酵的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on ethanol fermentation by S. cerevisiae

由图2知，在28～36℃范围内，在培养基中添加固态基质均能提高乙醇质量浓度。当发酵温度升高到30℃时，乙醇质量浓度达到最大值，比对照提高了28.6%。2.5 添加固态基质条件下的酵母菌乙醇发酵过程

图3 添加固态基质条件下乙醇发酵过程Fig.3 Time course of ethanol fermentation with the addition of rice hull to the medium

图3为添加固态基质条件下(稻壳2.5g/100mL、初糖浓度12g/100mL、温度30℃)酵母菌乙醇发酵过程。在0～48h内发酵液中乙醇质量浓度随着发酵时间的延长而增加。当发酵48h时，发酵液中乙醇质量浓度达到了最大值，随后渐趋于稳定并有下降的趋势。发酵液中葡萄糖含量则随着发酵时间的延长而逐渐减少，最后趋于0。由此可见，在添加固态基质条件下，酵母菌乙醇发酵的最适时间是48h，此时乙醇质量浓度达到51.8g/L，为理论产率的92.7%。

3 讨 论

在传统的酒精发酵过程中，酒精发酵浓度低，原料的利用率和酒精的转化率也低，能量消耗大，导致生产效率较差。对传统乙醇发酵技术进行改造，开发低成本乙醇生产新技术，受到国内外有关研究者的高度重视。通过在培养基中添加营养盐、氮源及其营养物能改善酵母生长环境，缩短发酵周期，提高酒精产量[5-8]。在高浓度酒精发酵条件下，加入渗透压保护剂，有助于增加酒精产量，提高糖利用率[9]。添加吐温-80和麦角甾醇的高浓度酒精发酵，最终酒精体积分数可以达15.32%[10]。采用工程菌株、固定化细胞等方法，能不同程度的提高原料转化率和产物的得率[11-13]。但这些方法由于在不同程度上增加了生产成本，对于大宗低值燃料的乙醇难于在工业上推广应用。

本研究在培养基中添加不同的农林废弃物作为酵母菌乙醇发酵的固态基质，对酵母菌乙醇发酵均有明显的促进作用。在4种不同固态基质中，稻壳对酵母菌乙醇发酵的促进作用最显著。固态基质的添加能有效改变酵母菌的代谢环境，为其发酵作用提供了有利的场所，从而提高原料转化率和产物的得率，具有经济、简便、高效等优点，对乙醇发酵生产具有重要的参考价值。

[1] 赵宝华, 张莉. 外加肌醇和钙离子对酿酒酵母乙醇发酵的影响[J]. 微生物学报, 1999(2): 174-177.

[2] 石尔, 肖泽仪, 黄卫星, 等. 硅橡胶膜生物反应器连续发酵与乙醇分离耦合动力学研究[J]. 四川大学学报: 工程科学版, 2007, 39(1): 93-97.

[3] HAYASHIDA S, FENG D D, HONGO M. Physiological properties of yeast cells grown in proteolipid supplemented media[J]. Agric Biol Chem, 1975, 39: 1025-1031.

[4] PATIL S G, PATIL B G. Chitin supplement speeds up the ethanol production in cane molasses fermentation[J]. Enzyme Microb Technol,1989, 11(1): 38-43.

[5] 张书祥, 肖亚中, 任杰. 添加营养盐对酒精酵母发酵的影响[J]. 生物学杂志, 1997, 14(1): 23-25.

[6] CASEY G P, MAGNUS C A, INGLEDEW W M. High gravity brewing:nutrient enhanced production of high concentrations of ethanol by brewing yeast[J]. Biotechnol Lett, 1983, 5(6): 429-434.

[7] DAMIANO D, WANG S S. Improvements in ethanol concentration and fermenter ethanol productivity in yeast fermentations using whole soy flour in batch and continuous recycle systems[J]. Biotechnol Lett, 1985,7(2): 135-140.

[8] THOMAS K C, INGLEDEW W M. Production of 21% (V/V) ethanol by fermentation of very high gravity(VHG) wheat mashes[J]. Journal of Industrial Microbiology, 1992, 10(1): 61-68.

[9] THOMAS K C, HYNES S H, INGLEDEW W M. Effect of particulate materials and osmoprotectants on very high gravity ethanlic fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994(5):1519-1524.

[10] 黄宇彤, 伍松陵, 杜连祥. 玉米酒精超高浓度发酵工艺条件的优化[J]. 食品工业科技, 2002, 23(8): 66-69.

[11] LINDSAY S, BOTHAST R, INGRAM L. Improved strains of recombinant Escherichia coli for ethanol production from sugar mix tures[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 43(1): 70-75.

[12] 宋向阳, 毛连山, 杨富国, 等. 海藻酸铝固定化酵母生产酒精的研究[J]. 林产化学与工业, 2002, 22(2): 43-46.

[13] 马家津, 吕跃钢. 以菊芋为原料利用固定化酶和细胞两步法发酵生产乙醇[J]. 北京工商大学学报: 自然科学版, 2004, 22(6): 8-10.

A Novel Method for Enhancing Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae

HUI Feng-li，CHU Xue-ying，KE Tao，ZHANG Cai-ying
(College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China)

Solid matrix was added to fermentation medium for exploring the effect of solid matrix on ethanol fermentation in yeast cells. Results indicated that the addition of 2 g of straw, peanut hull, rice hull or wood shavings to 100 mL medium could improve ethanol production by 15.5%－24.8%. Rice hull was the most suitable solid matrix and the optimal technological parameters for rice hull were found to be: rice hull amount 2.5 g/100 mL; initial glucose concentration 12 g/100 mL; fermentation temperature 30 ℃, and fermentation time 48 h. Under these optimal conditions, the actual production of alcohol reached up to 51.8 g/L, which was 92.7% of the theoretical value.

yeast；ethanol fermentation；solid matrix；rice hull

S216.2

A

1002-6630(2010)19-0292-03

2010-02-28

河南省科技厅科技攻关项目(092102110120)；河南省教育厅自然科学基金项目(2009A180012)

惠丰立(1965—)，男，教授，硕士，主要从事生物质能利用研究。E-mail：huifl@126.com