耐受性黄酒酵母YS6.2.5的选育及初步应用

夏艳秋，朱 强，汪志君，路 琦

(1.淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225001)

耐受性黄酒酵母YS6.2.5的选育及初步应用

夏艳秋1，朱 强1，汪志君2，路 琦1

(1.淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225001)

黄酒酵母的耐受性对黄酒酿造至关重要。对原始菌株YS分别采用乙醇-热冲击法、细胞紫外诱变法和原生质体紫外诱变法，结合高温驯育进行选育，筛选到一株在38℃能正常生长发酵的黄酒酵母突变株YS6.2.5。YS6.2.5体积小，近似圆形，产香好，产酸少，30℃时产酒精能力、酒精耐性、高糖耐性分别为9.0%、19%、30°Bx，38℃时相应指标分别为6.5%、20%、28°Bx。酿酒实验表明，其生理耐性强，酿酒性能好，遗传性状稳定，具有较好的工业应用前景。

黄酒酵母；耐受性；诱变育种；热效应；原生质体

黄酒是我国的特有酒种，是国家提倡发展的低度、营养、保健的发酵原酒，已成为时尚新宠。黄酒发酵是典型的半固态双边发酵，醪液浓度高、温度高、酒精度高是新工艺黄酒采用大罐深层纯种发酵的最大特点。一般的酿酒酵母最适生长发酵温度为25～28℃，耐酒精体积分数12%左右，20%以上的糖或盐所形成的渗透压便会对酵母生长产生抑制作用[1]。而黄酒发酵品温最高达40～42℃，糖分可高达40%以上，酒精体积分数为15%～20%，加上发酵后期养分不足等多种胁迫条件，极易导致酵母菌早衰、死亡，进而使糖化发酵双边失衡，却强化了杂菌的增殖，这是黄酒酸罐事故频发的主要原因，夏季尤为严重。因此，选育生理耐性强的黄酒酵母，尤其是耐高温黄酒酵母是黄酒业当务之急。然而，比起葡萄酒和清酒[2-4]，黄酒行业极少开展酵母菌耐受性的研究工作[5-6]，且停留在根据酵母菌的发酵情况和酒的风味筛选理想菌株，即“自然育种”阶段[7-8]，目前尚未见诱变选育耐受性黄酒酵母的报道。鉴于此，本实验拟采用紫外诱变和热效应等方法选育耐受性黄酒酵母，并初步研究其在黄酒酿造中的应用，旨在获取新型优良黄酒酵母以提高黄酒产量和质量，并为进一步推动对现行黄酒工艺体系的技术升级和改造提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄酒酵母(S. cerevisiae)YS由丹阳黄酒厂馈赠，扬州大学食品科学与工程学院微生物实验室保藏。

1.2 溶液与培养基

高渗缓冲液PBS：0.2mol/L磷酸盐缓冲液内含0.7mol/L KCl，pH5.8；脱壁酶液：2%蜗牛酶-PBS溶液(微孔滤膜过滤除菌)。

斜面培养基：麦芽汁培养基；完全培养基：YPD培养基；高渗再生培养基YPDP：于YPD中添加0.7mol/L KCl、50mmol/L CaCl2、20mmol/L MgSO4·7H2O、琼脂(上层1.5%，下层2%)；初筛培养基：TTC双层培养基；复筛培养基：大米糖化液。

除脱壁酶液外，以上溶液与培养基杀菌条件均为121℃、湿热灭菌15min。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌单细胞悬浮液(YSS)制备

接种已活化的酵母菌于麦芽汁培养基中，30℃、200r/min恒温摇床培养至对数期，3000r/min离心5min，所得沉淀即为酵母菌细胞，用生理盐水洗涤两次，并稀释成1.0×107cells/mL。

1.3.2 乙醇-热冲击处理

取5mL YSS，先在低体积分数乙醇中低温保持一段时间，然后在高体积分数乙醇高温下保持一段时间，梯度稀释后涂布TTC下层平板，38℃培养2～3d，倾倒TTC上层培养基，避光于30℃保温2～3h，挑取单菌落。

1.3.3 细胞紫外诱变及高温处理

取5mLYSS，置15W紫外灯下28cm处振荡照射不同时间，梯度稀释后涂布TTC下层平板，分别置30、34、38、42、45℃避光培养2～3d，倾倒TTC上层培养基，避光于30℃保温2～3h，挑取单菌落。

1.3.4 酵母菌原生质体制备与再生[9]

取5mL YSS，加5mL PBS，28℃保温5min，3000r/min离心10min，所得沉淀用PBS洗涤2次；加5mL脱壁酶液，28℃、150r/min水浴振荡保温100min左右；定时取样镜检，当90%左右的细胞转变为原生质体时，先1000r/min离心5min，使酵母细胞壁碎片沉淀，取上层混浊液3000r/min离心10min，所得沉淀即为原生质体，用PBS洗涤2次，梯度稀释后涂布YPDP平板，30℃培养2～3d即可再生出细胞壁。

式中：A为酶处理前细胞数；B为酶处理后未脱壁细胞数；C为酶处理后未脱壁的细胞数和原生质体再生细胞数的和。

1.3.5 原生质体紫外诱变[9]及高温驯育

将所得原生质体用PBS稀释成1.0×107cells/mL，置15W紫外灯下28cm处振荡、照射不同时间，用PBS梯度稀释后涂布YPDP平板，38℃避光培养2～3d，转移至TTC下层平板，然后在连续提高温度的条件下培养，倾倒TTC上层培养基，避光于30℃保温2～3h，挑取单菌落。

1.3.6 酵母菌发酵力实验

大米加水4～5倍煮成粥状，冷却至60℃，加入15%～20%的麸曲或麦曲，60℃保温糖化5h，糖化完毕(碘液实验不变色)过滤，调整滤液糖度，用乳酸调整pH3.9～4.1，备用。

500mL三角瓶中装200mL经稀释的大米糖化液，接种(接种量2.0×107cells/mL)，30℃或38℃静置培养5d，每隔24h振荡0.5h，测定发酵结束醪液理化指标。

1.3.7 酵母菌酒精耐性(或高糖耐性) 实验

用无水乙醇(或水)调整如1.3.6节糖化液中酒精体积分数(或糖分浓度)，装上发酵栓，每隔24h振荡称质量，至失质量小于0.2g，停止培养，综合酵母菌生长与总失质量等指标表征其酒精耐性(或高糖耐性)。

1.3.8 黄酒发酵工艺流程

原料大米→洗米→浸渍→蒸饭→淋饭→拌曲、接种酵母菌→发酵→后处理→干黄酒

1.4 分析方法

酵母菌细胞计数、形态、大小和生长曲线的测定参照文献[9]。黄酒理化指标的测定参照黄酒GB/T 13662—2 0 0 8《黄酒》。

2 结果与分析

2.1 乙醇-热冲击诱变结果

表1 乙醇-热冲击处理诱变结果Table 1 Mutation results of Saccharomyces cerevisiae by ethanol-heatshock

表1表明，单一热效应只能引起极少数酵母细胞变异或死亡，且正突变率较低，诱变效果不理想，而热和其他诱变因子的复合诱变则可以发挥各自的优点，从而取长补短，进而达到比较满意的结果。如先低温低酒精体积分数短时间、后高温高酒精体积分数长时间乙醇-热冲击处理的酵母菌存活率(14.17%)较适宜，且细胞萌发早、生长快，TTC染色显红色，表现出较好的酒精发酵能力、高温耐受性及酒精耐受性。而直接高温高酒精体积分数冲击处理，即使短时间也容易造成大量酵母菌死亡，且残存的极少数酵母菌由于受到强烈冲击，其发酵性能几乎全部丧失，TTC染色不显色。可见，即使采用复合诱变也以梯度处理为宜。根据TTC显色深浅可判断酵母菌产酒精能力的高低[10]：发酵能力强的酵母菌显红色，次之显粉红色、微红色，发酵能力极弱不显色。原始菌株YS经乙醇-热冲击处理，挑选48株在38℃生长发酵性能较好的菌株接种斜面培养基培养，摇瓶复筛所得6株较优突变株性状如表2所示。

表2 乙醇-热冲击处理后6株突变株性状Table 2 Properties of 6 mutants through ethanol-heat-shock

由表2可知，6株突变株在30℃时的各项理化指标均较接近，而38℃时则表现出较大差异，尤其是YS6发酵力最高，耐酒精体积分数为18%，且细胞大小合适，产酸适中，产香好。因此，挑取Y S 6为紫外诱变出发菌株，进一步提高其生理耐性。

2.2 紫外诱变、高温培养筛选结果

2.2.1 细胞紫外诱变结合高温培养

图1 YS6菌株细胞紫外诱变致死曲线Fig.1 Lethal curve of YS6 cells induced by UV

图1表明，YS6菌株细胞对紫外光非常敏感，随照射时间延长，其致死率呈快速上升趋势。鉴于致死率为75%～85%甚至更低时，正变率较高，产量提高的潜力也更大[11]，确定UV照射2min(致死率为82.15%)为YS6最适紫外诱变剂量。将不同照射剂量的酵母菌涂布TTC下层平板，培养结果见表3。

表3 YS6细胞紫外诱变后在不同培养温度下酵母菌生长结果Table 3 Yeast growth of YS6 cells induced by UV at different temperatures

热影响微生物细胞酶的活性，进而影响突变后细胞的修复过程，因而，在适宜的温度条件下培养经其他诱变因子诱变后的细胞，可望提高诱变的正变率并可定向选育耐高温/低温突变株[12]。表3表明，当培养温度高于38℃时，菌体蛋白变性，酶失活，酵母菌几乎全部死亡；低于38℃时，酵母菌仍能生长，但照射剂量过低诱变效果差，而照射剂量过高则导致部分酵母菌的发酵能力降低甚至丧失。UV照射2.0min、38℃培养时，酵母菌生长良好，诱变效果最好，证实了图1中紫外诱变剂量的可靠性。挑取照射2.0min、38℃培养的突变株60株，摇瓶复筛所得优良突变株YS6.2性状见表4，并以其为原生质体紫外诱变出发菌株。

2.2.2 原生质体紫外诱变结合高温驯育

预实验确定制备YS6.2原生质体的基本条件为：培养至对数生长早期，酶解温度为30℃，最适pH5.8，由于采用EDTA和β-巯基乙醇前处理后再生率下降了42.07%，故不需前处理。

图2 YS6.2原生质体形成与再生曲线Fig.2 Formation and regeneration of YS6.2 protoplast

图2表明，随着酶解时间的延长，原生质体形成率快速增加，而再生率急剧下降。酶解80min时，原生质体形成率为90.47%，再生率达13.45%，酶解120min时，原生质体形成率为99.99%，再生率只有0.75%，比酶解80min时下降94.42%。资料显示[9]，原生质体制备时，残留的少量细胞壁就像结晶时的“晶种”，可以提高原生质体再生率。可见再生率与原生质体的制备过程及原生质体形成率都有很大关系，本实验的目的是去除酵母菌细胞壁对紫外线的阻碍作用，再生率过低不利于诱变选育优良菌株，所以采取80min为最适酶解时间。其紫外诱变致死曲线见图3。

图3 YS6.2原生质体紫外诱变致死曲线Fig.3 Lethal curve of YS6.2 protoplast induced by UV

图3表明，YS6.2原生质体对紫外光的敏感度比完整细胞强，照射30s时，致死率为73.76%。因此，确定紫外照射30s为YS6.2原生质体最适紫外诱变剂量。

于再生完全培养基平板上，挑选38℃生长较慢、菌落形态好、TTC显红色的再生酵母菌56株，摇瓶复筛得8株发酵力强、产酸少、产香好的菌株。将这8株菌从33℃到38℃连续提高培养温度 (3代/梯度)，结合摇瓶复筛，最终筛选出优良突变株YS6.2.5，其能在38℃正常生长发酵，性状见表4。

由表4可知，经紫外诱变结合热筛选，30、38℃时菌株的各项生理指标都有明显改善。与原始菌株YS相比，突变株YS6.2.5产酒精体积分数分别提高32.35%和116.67%，耐酒精体积分数分别提高到19%和20%，产酸大大降低。另外，YS6.2.5形体变小、近似圆形，这样更适于酿酒，因为较小的细胞有较大的比表面积，可以增加单位菌体的产酒量，缩短发酵时间，凝聚性也好，近几年人们倾向于选育这种中小型的优良酿酒酵母。2.3 突变株YS6.2.5遗传稳定性

表5 传代培养对YS6.2.5性状的影响Table 5 Effect of passage on YS6.2.5 properties

突变株YS6.2.5于麦芽汁斜面培养基连续传代、发酵培养，性状见表5。

表5表明，突变株YS6.2.5连续传代培养15代，无论在30℃还是在38℃性状未见明显改变，说明其遗传性状是稳定的。

2.4 突变株YS6.2.5糖耐性

图4 糖度对酵母菌生长与发酵的影响Fig.4 Effect of sugar concentration on the growth and fermentation of yeast

由图4可知，随着发酵液糖度的提高，酵母菌生长与发酵的能力均呈先增强后降低趋势。其中，30℃时，突变株YS6.2.5的细胞数和产CO2量分别于28°Bx和30°Bx达到峰值，比原始菌株YS均提高了2～4°Bx，且YS6.2.5发酵各指标在达到峰值后下降幅度远小于YS。38℃时，YS6.2.5的细胞数和产CO2量均于28°Bx达到峰值，仅比30℃时其各指标峰值糖度降低0～2°Bx，且各指标在相同糖度的降低比例均小于50%。在较高的糖度条件下，38℃时YS6.2.5发酵各指标明显高于30℃时YS相应指标。以上分析表明，突变株YS6.2.5具有较强的高糖耐性和高温耐性，从而保证黄酒夏季安全生产。

2.5 突变株YS6.2.5用于黄酒酿造

由表6可知，即使在黄酒主发酵品温高达35℃以上时，突变株YS6.2.5仍保持旺盛的生命活力，至后酵结束，细胞数仍有1.0×107cells/mL，死亡率低于0.2%，节省约40%冷耗，发酵周期也大大缩短。且其成品酒酒精体积分数高、残糖低，氨基酸总量高，原料利用充分，酒体柔和清爽，较具典型性。值得注意的是，YS6.2.5成品酒中Arg含量较低。Arg在酵母菌生长发酵过程中可由菌体内精氨酸酶转化为尿素，尿素则进一步与乙醇生成有致癌作用的氨基甲酸乙酯(EC)[13]。国际标

表4 选育过程中菌株性状变化Table 4 Change in properties of strains during breeding

表6 YS6.2.5与YS成品黄酒理化指标比较

Table 6 Comparison of physico-chemical properties of rice wine products fermented by YS6.2.5 and YS准规定饮料酒中EC的含量不得超过30μg/L。通过选育不产或少产Arg(或尿素)的酵母菌则可以从根本上解除黄酒中EC的危害。另外，较少的Val可减少杂醇油的形成，并减轻酒的苦涩味。

菌株 酒精体积分数/% 总糖含量/(g/L)总酸含量/(g/L)氨基氮含量/(g/L)挥发酸含量/(g/L)挥发酯含量/(g/L)杂醇油含量/(g/L) 风格YS6.2.5 14.6 2.13 4.13 0.844 0.065 0.392 0.189 柔和清爽YS 13.1 3.68 4.97 0.785 0.127 0.313 0.468 醇厚稍涩菌株 Thr含量/(g/L) Val含量/(g/L) Leu含量/(g/L) Ile含量/(g/L) Phe含量/(g/L) Trp含量/(g/L) Lys含量/(g/L)Arg含量/(g/L)YS6.2.5 0.653 0.175 0.287 0.149 0.217 0.031 0.130 0.021 YS 0.605 0.240 0.259 0.125 0.242 0.029 0.125 0.367

3 讨 论

在全球水资源高度紧张的今天，选育和应用耐高温酵母已成为当前国内外研究的热门课题之一[14-15]。耐高温酵母具有生长速度快、生产效率高、耐受性能好、不易污染杂菌等优点，可节能降耗，对于胁迫条件多且复杂的黄酒发酵尤为重要。

胁迫处理能够引起菌体细胞质膜发生变异，并产生对应的胁迫抗性，这种保护机制被称为冲击应力，包括热激蛋白及海藻糖等，一旦细胞合成了这些应力，细胞便可以适应这些极端环境得以生存下去。Sanchez等[16]指出，酵母菌通过热和乙醇冲击均能产生热激蛋白。Watson等[17]则指出：热冲击在提高酵母菌耐热性的同时，亦可提高其酒精耐性及渗透压耐性等，将会获得具多重生理耐性的酵母菌。本实验采用乙醇-热冲击选育的YS6菌株，38℃发酵5d产酒精体积分数为5.5%，酒精耐性由14%提高到18%，为下一步选育工作奠定了良好基础。

在微生物的诱变育种工作中，热不仅具有诱变效应，而且在其他诱变剂诱变处理后可作为筛选条件，利用突变的多向性及筛选的定向性实现“定向”诱变育种，可提高诱变正突变率和筛选效率[12,15]。比起需要专用设备的其他物理诱变方法和多是剧毒药品的化学诱变方法，热诱变方法不仅设备简单、操作方便安全，而且热效应明显，可控性好，遗传稳定，必将受到科研工作者的广泛重视。

原生质体技术是一种新兴的育种方法，其中原生质体融合育种作为一种非特异基因重组技术倍受青睐，但在原生质体融合之前，需先对亲本加上多个遗传标记，此项工作费时费力，且影响菌体活力和一些有用的性状。而对原生质体直接进行诱变处理，方法简便，由于其易发生突变的位点裸露在外，因此对诱变剂更为敏感，正突变率更高且变异幅度也更大[18]。本实验采用紫外诱变结合热效应选育的耐受性黄酒酵母YS6.2.5经发酵验证，性状优良，遗传稳定。

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Breeding and Application of Tolerant Chinese Rice Wine Yeast YS6.2.5

XIA Yan-qiu1，ZHU Qiang1，WANG Zhi-jun2，LU Qi1
(1. School of Ocean, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China)

Tolerance of rice wine yeast is essential for brewing rice wine. In order to breed tolerant rice wine yeast, original yeast strain YS (Saccharomyces cerevisiae) was subjected to ethanol-heat-shock, UV-induced mutagenesis of cells and proptoplasts coupled with high temperature domestication to screen and obtain a mutant yeast YS6.2.5 with normal growth at 30 ℃ for rice wine fermentation. The mutant YS6.2.5 had the characteristics of small size, round shape, good aroma-producing favor and low acid-producing property. The alcohol-producing capability, alcohol tolerance, sugar tolerance of YS6.2.5 were 9.0%, 19% and 30 °Bx at 30 ℃, and 6.5%, 20% and 28 °Bx at 38 ℃, respectively. Fermentation tests showed that the YS6.2.5 had strong physiological tolerance, high fermentation power, stable hereditary, and better industrial application prospect.

rice wine yeast；tolerance；mutagenesis breeding；thermal effect；protoplast

Q936

A

1002-6630(2010)23-0228-05

2010-01-25

夏艳秋(1977—)，女，讲师，硕士，主要从事发酵工程及酶技术研究。 E-mail：xyq78412@163.com