试管婴儿技术的发展与探讨

彭 靖 卢大儒

①博士,②教授,复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433

试管婴儿技术的发展与探讨

彭 靖①卢大儒②

①博士,②教授,复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433

罗伯特·爱德华兹 试管婴儿 胞内单精子注射 胚胎移植前遗传诊断

2010年诺贝尔生理学或医学奖授予了“试管婴儿之父”罗伯特·爱德华兹。试管婴儿技术是一项影响深远的重要技术,为人类辅助生育技术带来了重大变革。试管婴儿技术主要是融合了体外受精技术与胚胎移植技术,旨在帮助各种不孕不育症夫妇繁育后代。30多年来,在原有基础上,试管婴儿技术还发展演变出了胞内单精子注射以及胚胎移植前遗传诊断等其他方法,使得其功能大幅扩展。本文将对试管婴儿技术,发展历程和引发的伦理社会问题作一个简要介绍。

1 前言

在20世纪70年代,有这样一对普通的英国夫妇：约翰·布朗和莱斯利,他们感情深厚,却被无法繁育后代的问题所困扰。莱斯利女士因为患有输卵管堵塞病症,9年来一直没有怀孕,虽然多次就医但仍不见好转的迹象,迫切想拥有可爱宝宝的愿望与残酷的现实让他们无比痛苦。在那之前世界上像这样患有无法治愈的不孕不育症夫妇还有很多,可是当时医学技术的局限性只能让他们留下绝望和遗憾。然而布朗夫妇无疑是幸运的,他们遇到了致力于试管婴儿研究的罗伯特·爱德华兹(Robert G.Edwards)和帕特里克·斯特普托(Patrick Steptoe)。虽然被告知试管婴儿技术可能会带来风险,但是布朗夫妇不愿放弃哪怕是一丝一毫的希望,于是莱斯利在1977年11月10日接受了试管婴儿手术。令她无比惊喜的是,她竟然真的成功受孕了。1978年7月25日,莱斯利在英国曼彻斯特的奥尔德姆医院成功地产下了世界上第一个试管婴儿——路易斯·布朗。4年后,布朗夫妇的第二个孩子娜塔莉·布朗也同样通过试管婴儿技术出生。就这样,试管婴儿技术为一个原本可能面临不幸命运的家庭带来了新生,也标志着一个崭新的时代由此拉开了序幕。

时过境迁,32年之后,诺贝尔奖评委会宣布,将2010年诺贝尔生理学或医学奖授予罗伯特·爱德华兹,以表彰他在体外受精技术领域的开创性贡献,并称其研究成果是现代医学发展的里程碑。爱德华兹早在20世纪60年代就开始进行体外授精方面的研究,由于其开创性的工作、卓越的成就和引起的争议而备受世人瞩目,更被誉为“试管婴儿之父”。那么为何距世界上第一例试管婴儿诞生之后的32年,这一造福于人类、为人类生殖技术带来深远影响的技术才终于得到诺贝尔奖的肯定?试管婴儿究竟是什么样的技术,它的发展又都经过了哪些历程呢?由它带来的社会伦理方面的问题又有哪些?本文将为您就这些问题一一解答。

2 试管婴儿技术的发展历程

从20世纪60年代爱德华兹与帕特里克·斯特普托合作成立世界上第一个体外受精研究中心,到1978年世界上第一例试管婴儿诞生,到现今全世界约有400万人通过试管婴儿技术出生并繁衍他们自己的后代,试管婴儿技术走过了其独特的发展道路,试管婴儿至今不仅在数量上超过了400万,而且试管婴儿的技术也不断发展,历经了三代,挑战了一个又一个技术难度。

2.1 试管婴儿技术的起源

人们对于试管婴儿相关技术的研究由来已久,甚至可以追溯到18世纪人们对动物生育技术的研究。真正拉开这道序幕的,是源于20世纪人们对于哺乳动物排卵、男女不孕不育症、内分泌学、胚胎学和遗传学研究的兴起。

有意思的是,最开始人们对辅助生育技术的研究竟然是出于避孕研究的目的,其中关键的内容是对卵细胞发育周期的深入认识。20世纪初,科学家们在研究了不同动物的卵细胞在体外发育成熟的过程后[1],推测人卵细胞的发育成熟需要12 h。但遗憾的是,这一估计是错误的,并导致了后续一系列人卵细胞体外受精的实验都失败了,因为人卵细胞的实际成熟时间远不止12 h。直到1965年,才由爱德华兹对这一实验结果做出了纠正,指出某些哺乳动物包括灵长类动物的卵细胞在体内或体外环境发育成熟的时间是固定的,即在出现黄体生成素峰或注射人绒毛膜促腺性激素(HCG)37 h后卵细胞发育成熟[2]。

试管婴儿技术起源的另一重要基础,是对脑垂体腺和促性腺激素作用的深入认识,并开始能够利用生物制品诱发超排卵反应。1957年,Fowler首次在成熟的哺乳动物体内成功诱发超排卵,卵子数目的增加提高了产下后代的数量[3]。之后,爱德华兹使用枸橼酸氯米芬和HCG来控制卵母细胞成熟时间,使得取卵时机变得更容易把握。与此同时,Lunenfeld改进了刺激卵细胞发育周期的方法,增加使用了促卵细胞生成素(HMG)来控制卵细胞发育[4],这一方法后来被称作控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)。此外,该领域的另一个进步是促性腺激素释放素促效剂(gonadotrophin-releasing hormone agonists,GnRHA)的使用,它能避免卵母细胞早熟,让卵母细胞的发育周期变得更有规律。

当时,科学家们对人卵细胞的发育周期有了全面的认识,甚至还可以对这一发育过程进行人为的控制,但是他们还需要解决一个问题,那就是如何将这些成熟的卵细胞从人体内安全的取出来。在这一时期,爱德华兹遇到了他职业生涯中的一位重要合作者,来自奥尔德姆的妇产外科医生帕特里克·斯特普托(图1)。斯特普托擅长利用在当时看来同样饱受争议的腹腔镜检技术从患有输卵管性不孕的妇女体内取出成熟的卵细胞[5],这种技术避免了传统剖腹术取卵对患者造成的创伤。

图1 帕特里克·斯特普托(左)和罗伯特·爱德华兹(右),拍摄于1969年2月14日伦敦

准备就绪,科学家们开始尝试将取到的成熟人卵细胞进行体外受精实验,这一过程似乎进行得很顺利。然而在接下来的受精卵和胚胎体外培养中又遇到了问题,因为人们一直找不到条件合适的培养液成分,直到丙酮酸脂的出现。丙酮酸脂是鼠胚胎发育代谢必不可少的成分,而含有高浓度丙酮酸脂的培养液也正适合人类胚胎的体外培养[6]。

至此,在解决了上述几个方面的问题之后,试管婴儿技术初显雏形。

2.2 第一代试管婴儿技术

1978年路易丝·布朗的诞生,标志着试管婴儿技术的成熟以及临床运用上的成功[7]。随后越来越多的试管婴儿在世界各地接连诞生,1988年3月,中国首例试管婴儿郑萌珠在北京医科大学第二临床医院诞生。如今这些试管婴儿有的也通过自然繁衍的方式生产了自己的后代。

第一代试管婴儿技术,又被称为体外受精联合胚胎移植技术(in vitro fertilization,以下将简称为IVF)。它是借助内窥镜或B超,从妇女卵巢中取出成熟卵子,并与精子在试管或培养皿中一起培养以生成受精卵,受精卵进一步发育成胚胎后,再将胚胎移植到未来母亲的子宫内,使胚胎在母体子宫内继续发育直至成为成熟胎儿(图2)。可见,试管婴儿并不是在试管中长大的婴儿,只是使原本应发生在人体内输卵管处的自然受精过程改由在体外试管环境中进行,这也正是试管婴儿这个名称的由来。当胚胎移植回子宫着床后的发育过程就和正常受孕没有区别了。

图2 体外受精联合胚胎移植技术图解

早期IVF技术形成与发展的目的,是为了解决因为女性疾病原因而导致的不孕症,例如输卵管堵塞,子宫内膜异位等。这些不孕症通常采用辅助生育技术是无法治愈的,因此可以说,IVF技术是人类生殖技术的一个重大突破。

一般来说,IVF技术主要有以下步骤：诱发超排卵,取卵,取精,体外受精,胚胎移植。诱发超排卵主要是采用药物促进的办法,使卵细胞发育不受自然周期限制,目的是能获得多个健康成熟的卵子。取卵、取精后,将它们共同置于模拟人体内环境的培养基中,完成体外受精过程。待受精卵分裂至4～16细胞期胚胎后,挑选若干个发育较好的胚胎,移植到母体的子宫内,待胚胎着床后继续发育。其中,精子、卵子可取自夫妻双方,也可由他人提供。

为了提高IVF成功率,一般会取多个成熟卵子,分别体外受精后培育成多个胚胎再植入母体。通常情况下会同时植入2～3个胚胎,但也随母体健康状况、年龄、有无流产史等因素改变。随着冷冻-冻融技术的发展与成熟,可以将剩余的成熟卵子或胚胎保存起来,以备在移植胚胎受孕不成功后可以进行再移植[8]。IVF技术的成功率约30%,随着女方年龄的增长,成功率明显下降[9]。

值得一提的是,虽然对于辅助生育技术的研究由来已久,科学家很早就用兔卵细胞成功的进行过试管内受精[10],但是一旦想把这一技术应用在人身上却遇到了重重阻力。在那个时候,爱德华兹与斯特普托的工作遭受到了来自包括科学界、宗教人士、政府等各方的激烈反对。英国医学研究理事会拒绝了他们的研究资金申请,他们本人也多次遭受控诉。在这种困难的条件下,他们只能依靠少量私人捐助的资金来维持自己的研究,直到第一个试管婴儿的诞生。

1980年,爱德华兹与斯特普托一起创办了博恩霍尔诊所以继续他们关于IVF技术的研究,并培养相关的专业人才。至1988年,在博恩霍尔诊所共有1000例试管婴儿诞生,也正是在同一年,斯特普托逝世,未能看到他和爱德华兹所开创的技术给现今世界带来的影响以及诺贝尔奖对他们成绩的肯定。

2.3 第二代试管婴儿技术

如果说,第一代试管婴儿技术解决的是女性不孕的问题,第二代试管婴儿技术则是针对男性精子受精能力的问题而发展起来的。

第二代试管婴儿技术也叫胞质内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,以下称ICSI),又称显微受精,它是IVF技术发展应用中的重要拓展。这一技术在1992年首次临床应用成功[11]。

ICSI技术特点是通过显微操作技术,直接将单个精细胞注入卵细胞来帮助卵细胞受精。其中,显微操作所用到的设备包括：显微操作器、微量注射器、微量加样器。首先用微量注射器吸附固定住成熟卵细胞,然后用微量加样器取出经过去尾固定的单个精子,将微量加样器穿透卵膜到达卵细胞质中释放精子实现受精(图3)。

图3 胞质内单精子注射图解

传统的IVF技术除了要求有成熟的卵母细胞外,还对男性提供的精子数量和质量都有很高的要求,如果男性精子受精存在功能问题,传统的第一代IVF就无能为力了。ICSI技术打破了这一限制,理论上只要取到一个精子就可以使卵细胞受精,提高了卵子受精的成功率。因此它适用那些由于男性精子原因造成的不孕症,如畸形活精子症,精子数目过低,克氏综合症(Klinefelter’s syndrome)等[12-13]。ICSI技术成功率与 IVF相当,约25%,也就是增加了由于男性原因不育患者的25%的怀孕机会。

在自然生理状态下,精子与卵子结合是有竞争过程的,第一个遇到卵子的精子穿过卵膜后诱发卵膜变硬以阻止其他精子的进入。但是在ICSI技术中这一竞争过程不存在了,导致人们对所选精子质量的担忧。2006年一种称为PICSI的辅助技术获得试用批准,在一定程度上弥补了这一缺陷。其主要方法是将透明质烷(hyaluronan)水凝胶微滴结合在培养皿上,加入准备好的精子然后选取结合在微滴上的精子即可。因为透明质烷是包裹卵细胞凝胶层的主要成分,健康的精子能够自己结合在透明质烷上。研究表明,能够结合在透明质烷上的精子发育的更成熟,而且有相对较少的DNA链断裂和较低的非整倍性水平。

ICSI技术的出现使得IVF的应用范围得以大大拓展。对于从最开始的由于女性输卵管阻塞、子宫内膜异位等原因造成的不孕症,到由于男性精子问题、自发型生育力低下等原因造成的不育症,体外受精联合胚胎移植技术都成为了可能有效的最终解决方案。

2.4 第三代试管婴儿技术

第三代试管婴儿技术又称为着床前胚胎遗传诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD),或叫胚胎筛选。

20世纪80年代,随着IVF技术的长足发展,对某些遗传病病因的深入了解,以及在聚合酶链式反应(PCR)技术上取得的突破,PGD技术应运而生[14-15]。它的方法概括来讲,就是对体外受精后培育而成的多个胚胎,根据解剖学、生理学或遗传学特征来进行诊断并做出筛选,从中选择最符合优生学原理的胚胎植入母体,目的在于避免植入存在遗传缺陷风险的胚胎[16](图4)。首例通过PGD技术检测的试管婴儿于1990年顺利诞生[17]。

图4 着床前胚胎遗传诊断技术图解

PGD技术带来的意义是革命性的,它使得IVF的应用不再是仅仅解决不孕不育的问题,而且还能够提高生育质量。PGD技术可以被看作是另一种意义上的产前诊断和一种优生学方法。

PGD技术主要包括两个操作步骤：活体组织检查和遗传诊断。

活体组织检查是指在胚胎的极体期[18]、卵裂期或囊泡期,通过机械、化学或激光方法打开卵透明带,通过挤压或抽吸技术取出一个(或多个)细胞待检查。

遗传诊断主要是依靠聚合酶链式反应(PCR)相关技术或荧光标记原位杂交(FISH)技术,前者主要用来诊断单基因遗传病,后者主要用来诊断染色体异常。随着分子生物学技术的进步,其他诊断方法如全基因组扩增、比较基因组杂交等也在发展中。这些诊断方法的进步使得PGD检测的敏感度和精确度都大大提高[19]。

PGD技术适用于那些想要繁育后代、本身却患有高遗传风险疾病的人群,包括患单基因遗传病(如常染色体隐性遗传病、常染色体显性遗传病和X染色体连锁遗传病等)和染色体结构畸变(如非整倍体[20]、染色体易位等)。那些有可能通过PGD技术规避的遗传疾病包括：常染色体隐性遗传病如囊性纤维病、地中海贫血、镰状红细胞贫血;显性遗传病如肌强直性营养不良、亨廷顿舞蹈病;X染色体连锁遗传病如脆性X染色体综合症、A型血友病、进行性假肥大性肌营养不良等。

在PGD的基础上,还发展起来了相似但应用更普遍的着床前胚胎遗传分析(preimplantation genetic screening,PGS)方法。它并非以规避遗传疾病为目的,而是运用PGD方法选出相对比较健康的胚胎来植入母体,避免由于疾病或先天缺陷造成的妊娠终止,其目的是增加胚胎移植后的受孕成功率。因此主要适用于想要怀孕的高龄妇女、有复发性流产史或多次胚胎植入不成功的妇女[21]。

着床前胚胎单倍型分析(preimplantation genetic haplotyping,PGH)是在PGD基础上发展而来的又一临床实验方法,其特点在于使用了DNA指纹印记分析来进行遗传诊断,而不再仅仅是鉴别某些具体的遗传标记。

PGD的技术关键在于单细胞或少量细胞的基因诊断,在染色体水平和大片段基因变异水平进行检测相对容易,但是进行单基因突变的检测具有一定的技术难度,虽然目前已经发展了针对少量细胞甚至单细胞的基因扩增技术,虽然PGD理论上已经能够检测单细胞的基因突变等遗传学异常,但是结果不太稳定,不同实验室之间稳定性和重复性需要进一步提高和完善,不是每种基因异常均可以进行检测,这有点类似精细的技术活,需要指出的是,以上介绍的从第一代到第三代试管婴儿技术,它们的区别主要在于所适用的情况不同,而并不是疗效上的差异。

表1 三代试管婴儿技术的比较

3 试管婴儿技术带来的争议

试管婴儿技术从发展至今,一路走来争议不断。然而在第一个试管婴儿诞生32年之后得到诺贝尔奖的垂青,也表明了国际社会在对试管婴儿技术进行长期的观察与讨论后,开始逐渐认可了这一对全人类带来深远影响的技术。那么试管婴儿技术带来的影响和争议都有哪些呢?

3.1 自身缺陷

首先,因为试管婴儿技术本身存在缺陷,决定了这一技术的应用也是存在风险的。

例如,通常为了获得数目较多的成熟卵子,都会对患者使用促排卵药物,这会导致卵巢过度刺激综合症,引起卵巢功能早衰,同时也可能增加卵子携带变异基因的几率,而且取卵过程本身也存在对女性身体造成损伤或感染的可能。

此外,由于试管婴儿成功率较低,为了提高受孕成功率,大多采用一次植入多个胚胎的方法。但是这会导致多胎率上升,而多胎会增加婴儿早产、体重过轻、孕妇并发症的风险[22-23]。如果胚胎植入后有不止一个胚胎在正常发育,可以通过人为减胎来降低多胎率,但是减胎过程本身也同样是存在风险的。比较好的解决办法是结合胚胎冷冻技术,实施单胚胎移植,当一个疗程不成功时,取出冷冻胚胎进行下一个疗程。

虽然没有直接证据表明试管婴儿比普通婴儿先天缺陷率高,或在智力发育方面有差异[24-25]。但通过试管婴儿技术,尤其是ICSI技术来实现体外受精时,确实增加了将精子携带的缺陷基因遗传给后代的风险。而且对于那些由不明原因造成的不孕不育,使用试管婴儿技术有可能会使不明缺陷基因也有机会在整个人类的基因进化中保存并流传下去,由此对后代造成的可能影响仍难以估计。

另外,对于PGD技术以及由此衍生出来的 PGS、PGH其他技术,都是基于对多细胞胚胎中的一个卵裂球作遗传诊断后的判断,但是由于胚胎染色体镶嵌型现象的存在,所以诊断的风险在于选取的那一个细胞是否能真实反映整个胚胎的特性。假阴性结果会导致误选畸形胚胎,而假阳性结构会导致正常胚胎被弃用。

更何况,PGD及其衍生技术并非能够解决所有基因缺陷的检测,理论上的意义有时在实际应用中则会产生意想不到的结果。

早期胚胎发育时生物体表观遗传学发生巨大复杂变化的关键时期,经历不同处理的体外受精的受精卵,其胚胎发育的表观遗传学细微的差异均可能对胚胎发育及其胚后成体发育产生重要影响,而这方面目前缺乏相关的研究报道。

3.2 伦理问题

从1978年第一例试管婴儿诞生至今,30多年来全世界已有400万人通过体外受精技术出生,现在,这些试管婴儿也开始繁育自己的后代。试管婴儿技术的普及,也会带来诸多潜在的社会问题。

人类的自然繁衍一向被宗教人士视为上帝权利的禁区。试管婴儿技术的出现却挑战了这种权威,使实验室诞生婴儿成为可能。对于试管婴儿的争论和批判从来就没有停止过,即便是这项技术获得了诺贝尔奖的肯定之后,宗教人士仍然认为它在某些方面违背了人类伦理,比如那些在IVF过程中多余出来未经使用的胚胎的命运。那些多余胚胎或被销毁或被无限期冷藏,如果认为精子与卵子结合是生命的开始,那么销毁胚胎无疑就是对人类生命的扼杀。

IVF技术创立的初衷是帮助那些传统的已婚不孕家庭得到后代,可是随着技术的发展和应用面的拓展,IVF在越来越广泛的人群中得到应用。它使得婚姻和繁育后代之间不再存在必然联系,同性恋夫妇、未婚女性都可以通过这种方法获得后代。而且,在IVF技术中,卵子提供者与受孕者可以是不同的人,导致产下的试管婴儿可以有两位母亲。以上由此会形成新的家庭模式和社会人群,并造成家庭感情纷争与家庭财产归属的混乱。

对于试管婴儿自身来说,由于他们独特的身世,可能会受到周围人群的更多关注、误解甚至敌意,使他们面临来自自身心理、社会舆论的压力,容易产生情感紊乱与心理疾病[26]。

更关键的是,“试管婴儿”技术的广泛运用催生出了规模庞大的买卖市场,在中国由于缺乏对辅助生殖技术实施的各个环节严格立法,即便有了一定的规范,也没有得到有效的执行,在巨大经济利益的驱使下,地下精子库、卵子库、胚胎存放冷库和代孕母亲群体等盛行,更有所谓的名人精子库、博士精子库来误导患者。这些来源不明的精子和卵子,质量无法保障,大大影响人口素质。

谁来检测和保证提供精子的质量?什么是优质精子?谁能保证供精者有限的次数,辅助生殖的资质如何规范?

尽管试管婴儿技术从它产生的那一天开始就饱受争议,但它毕竟是在一路坎坷中向前发展,而且为千千万万想要拥有后代的不孕不育夫妇带来了希望。人类社会存在基础之一就是繁衍后代,不孕不育,没有后代,人类社会何以为继?不管有什么争议,都比不上给人带来生育的希望更加重要。诺贝尔生理学奖授予爱德华兹,表明这项技术已经得到了国际社会广泛的认同,也已经为千家万户造福。我们有理由相信,在加强监管的前提下,这一技术一定还会为人类带来更多的益处。任何科学技术的开创与发展,都应该以服务人类为最终目的,这才是人类社会进步的根本意义所在。

(2010年11月16日收到)

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(责任编辑：温文)

Introduction of Test Tube Baby：History and Application

PEN G Jing①,LU Da-ru②
①Ph.D.,②Professor,the State Key Laboratory of Genetic Engineering,SchoolofLifeScience, Fudan University, Shanghai 200433,China

The 2010 Nobel Prize in Physiology or Medicine was awarded to Robert G.Edwards,regarded as“the father of Test Tube Baby”.The Test Tube Baby,known as a marvelous assisted reproductive technology,has brought significant influence into human society.Test Tube Baby was a technique merging in vitro fertilization and embryo transfer to help the infertile couples have descendants.The intracytoplasmic sperm injection(ICSI)and preimplantation genetic diagnosis(PGD)were the development and extension result of Test Tube Baby.In this essay,a brief introduction to the history,application and ethical issues of Test Tube Baby were given.

Robert G.Edwards,Test Tube Baby,in vitro fertilization(IVF),intracytoplasmic sperm injection(ICSI) ,preimplantation genetic diagnosis(PGD)

10.3969/j.issn 0253-9608.2010.06.006