大肠杆菌可溶性蛋白质双向电泳条件的建立

尹燕霞 赵长云 刘照蓬 徐风亭 刘 进 李 森 向本琼

北京师范大学 北京 100875

大肠杆菌可溶性蛋白质双向电泳条件的建立

尹燕霞 赵长云 刘照蓬 徐风亭 刘 进 李 森 向本琼

北京师范大学 北京 100875

本文研究的主要目的是建立大肠杆菌可溶性蛋白质组的双向电泳技术，以等点聚焦为第一向，SDS-PAGE为第二向进行双向电泳，并对样品处理方式、蛋白上样量和染色方法等关键因素和环节进行了比较研究，通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。采取的方法具有较高的分辨率和重复性，为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础，成功地用于了本科实验教学中。

蛋白质组；可溶性蛋白；双向电泳；实验教学

随着时代技术的发展进步，大学实验教学也迎来了自身的变革，许多在以前看来较为复杂的实验技术，现在已经开始纳入本科实验教学的范畴。为了培养学生综合实验能力和创新能力，双向电泳（Two Dimensional Electrophoresis，2-DE）技术作为蛋白质组学最基本最常用的实验技术引入了本科实验教学，丰富了本科生实验的内容，促进了高校实验教学体系的建设。

蛋白质组学是一种基因组所表达的全套蛋白质，是目前生命科学研究中的一个热点。2-DE技术作为蛋白质组学3大关键核心技术之一,包括蛋白质的提取、等电聚焦(Isoelectrofocusing，IEF)、SDS-PAGE和凝胶染色等步骤,它是唯一能同时将上千种蛋白质同时分离和展示的方法,也是目前分析复杂组份蛋白质分辨率最高的工具,是蛋白组学研究中主要的分离技术,为蛋白质的纯化、分离、鉴定提供可靠的保障。建立和完善各种组织细胞在不同生理、病理条件下的2-DE条件,是进行蛋白质组研究的前提。通过对大肠杆菌的可溶性蛋白进行2-DE分离,对电泳条件进行筛选和优化,将之成功地用于了本科实验教学中,同时也为其蛋白质组学的研究提供有益的参考资料,为差异性表达蛋白的筛选、克隆和功能研究奠定基础。

一、实验材料与实验方法

1.实验材料

主要试剂包括两性电解质Bio-lyte3-10、等电聚焦胶条（7cm，pH3-10）（Bio-rad）、低熔点琼脂糖，其他试剂均为分析纯。

主要仪器包括Bio-rad双向电泳仪、垂直板电泳槽和Bio-rad PDQest分析软件。

2.实验方法

(1)提取可溶性蛋白

37℃，180rpm培养大肠杆菌BL21DE3过夜，6000rpm离心15min，收集菌体沉淀，超纯水快速冲洗菌体沉淀，用裂解液（8M尿素、4%CHAPS、2%Bio-Lyte、40mM DTT)裂解，室温放置20min，超生破碎（功率1200W，超声2秒，间隔10秒，超声40次），12000rpm离心20min，收集上清，透析与超滤浓缩，Bradford 法测定蛋白质浓度大约10mg/ml，-20℃冰箱保存备用。

(2)样品处理

将蛋白质样品100µl与400µl水化上样缓冲液（8M尿素、4% CHAPS、65mM DTT、0.2%(w/v) Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝）混合，上样体积150µl，上样量为300µg。

(3)IEF电泳

从-20℃冰箱取出冷冻保存的IPG（Immobilized PH Gradient、7cm，pH 3-10）预制胶条于室温放置10分钟。沿着水化盘中槽的边缘至左而右加入样品。当所有的蛋白质样品都已经加入到水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG 胶条上的保护层。分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序如下。

水化 50V 12小时（17℃） 主动水化

S1 250V 线性 30分钟 除盐

S2 500V 快速 30分钟 除盐

S3 4000V 线性 3小时 升压

S4 4000V 快速 20，000伏小时 聚焦

S5 500V 快速 任意时间 保持

选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。（30-50μA/根）

设置等电聚焦时的温度。（17℃）

等点聚焦结束后，取出胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

（4）平衡

电泳完毕后取出胶条，用MilliQ水浸湿的滤纸轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，将胶条置于平衡缓冲液I（37.5mM Tris-HCl pH8.8、20%甘油、6M尿素、2%SDS、2%DTT）中，水平摇床上缓慢摇晃15min。第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液。再加入胶条平衡缓冲液II（37.5mM Tris-HCl pH8.8、20%甘油、6M尿素、2%SDS、2.5%碘乙酰胺），继续在水平摇床上缓慢摇晃15min。

（5）第二向SDS-PAGE 垂直板电泳

主要根据蛋白质的分子量分离蛋白质。浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%。将已平衡好的一向胶条置于二向凝胶的上端，用低熔点琼脂糖封胶液（0.5%低熔点琼脂糖、25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1%SDS、0.001%溴酚蓝）封固胶条。低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液（25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1%SDS），电泳5mA/ gel/7cm，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，调至电流20-30mA/gel/7cm，待溴酚蓝指示剂达到凝胶底部边缘时停止电泳。

（6）染色与实验结果分析

电泳完毕后的凝胶进行考马斯亮蓝G250染色、脱色，扫描图像，应用PDQest软件分析电泳结果。

二、结果与讨论

1.结果

我们对大肠杆菌可溶性蛋白采用不同条件进行2-DE，优化电泳条件，获得了比较满意的电泳图谱（见图1）。应用PDQest软件初步分析，蛋白质上样量为300µg，pI3～10时，对7cm线性胶条进行蛋白点检测，获得80多个蛋白质斑点，由图1可知BL21菌种蛋白质集中在pI 值3.5～7.20。

图1 大肠杆菌蛋白双向电泳图

在相同实验条件及参数设置情况下，4个本科生班级的学生2-DE实验结果图谱非常相近，图谱的重复性较好。

2.讨论

本实验以BL21大肠杆菌总蛋白为研究对象进行2-DE分析，并对实验过程中样品制备、电泳条件等进行了筛选和优化。

(1)样品制备

样品制备和溶解是2-DE最为关键的问题。对不同类型的蛋白质进行样品制备时需要采用不同的方法和条件,如果样品制备过程出现问题将直接影响2-DE的结果与分析。首先样品提取过程中应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性,因此在蛋白的制备过程中应选择合适的增溶试剂、表面活性剂和还原剂。其次要注意尽量避免核酸、多糖、盐类、脂类等分子对蛋白质的干扰,同时应加入适当的蛋白酶抑制剂等。蛋白质容易受温度所影响,所以样品制备过程应在低温下进行,以免造成蛋白质的降解,同时防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀,保证蛋白质样品与第一向电泳的相容性。在整个电泳过程中，要始终保持蛋白质的溶解状态。有效的可重复的样品制备方法是双向电泳成功的关键。我们经过反复试验,最后所用到的细胞裂解液配方和超声破碎的方法使蛋白可以更好的释放和溶解,但是由于破碎过程可能产生热量,所以要注意对破碎功率的控制,同时要使破碎过程处于冰浴环境中。

(2)上样量

上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100µg（银染）到500µg（考染）之间。本次实验我们的上样量为300µg，结果中的蛋白点较清晰，可辨别的点也很多，达到了较满意的效果。如果样品蛋白浓度很低，就需要进行浓缩。浓缩的方法很多，大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来。我们采用了透析法和超滤法联用，先把样品透析到一个比较干净的环境，再进行超滤，既浓缩了样品，又起到脱盐的目的。

(3)不同聚焦时间对2-DE结果的影响

2-DE运行参数的选择直接影响2-DE图谱的质量，选择不适合的电泳参数会导致双向电泳图谱上出现横向或纵向条纹、蛋白点的拖尾及不规则的蛋白质点，使几个蛋白点连在一起或成线状，导致蛋白点的等电点难以确定，因此2-DE参数至关重要。理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。如果聚焦时间短，容易在靠近阳极端的胶条上产生蛋白沉淀，在第二向电泳后的凝胶上形成纵条纹；如果等电聚焦不完全，在凝胶上容易产生水平条纹。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变形，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失，影响电泳结果，因此最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。经过反复实验发现采用电压4000伏(7cm胶条)、20000伏小时效果较好。由于我们的样品中含盐量较少，选用线性升压，节省了聚焦时间。实验中还发现在聚焦盘的两端电极处搭上盐桥(帮助除盐)和选择适宜的总伏时等参数可以有效地减少2-DE凝胶中常见的横、纵纹现象。

(4)关于染色

目前实验室最常用的显色方法是考马斯亮蓝染色和银染。其中考马斯亮蓝染色灵敏度较低，但价格低廉、易于操作、无毒性、重复性好。银染法是非放射性染色方法中最灵敏的，灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，但银离子对质谱仪干扰严重，脱银的方法复杂，不易于掌握，所以银染一般用于分析。我们在上样量相同的情况下，分别进行了考马斯亮蓝染色与银染，结果表明，银染比考马斯亮蓝染色检测到相对较多的点，但由于银染过程较为繁琐、重复性较差，而且银染的图像背景较为模糊，可能会对软件分析造成影响，在实验过程中要尽量避免人为的因素，所以从教学的角度综合考虑，在学生实验中选用了考染，得到的结果也较清晰。

三、结束语

目前2-DE是蛋白质组学研究的主要技术，这项技术本身仍然存在着局限性，如对于低表达量蛋白、膜蛋白的分离还较为困难等。研究建立了大肠杆菌可溶性蛋白质2-DE技术，获得了分辨度高、重复性可靠的双向电泳图谱，在完成了可溶性蛋白质组的分离、分析与鉴定后，可以进一步进行细胞核蛋白及各个细胞器蛋白2-DE条件的摸索，一方面有望分离鉴定出更多的新蛋白、新基因，完善大肠杆菌细胞蛋白质组，另一方面可以充分调动学生的积极性，培养学生的创新精神和实践能力。这也是教师在教学过程中不断探索的动力和源泉。

总之，在本科实验教学中，双向电泳技术作为一门新引入的实验技术为培养创新人才提供了更高、更广的教学平台，而且有利于促进教师自身知识、能力的提高，促进学校整体教学水平的提高，促进实验室建设的发展。

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Improvement in two-dimensional gel electrophoresis of soluble proteins in escherichia coli

Yin Yanxia, Zhao Changyun, Liu Zhaopeng, Xu Fengting, Liu Jin, Li Sen, Xiang Benqiong
Beijing normal unviserty, Beijing,100875, China

The main purpose of the study is to establish groups of soluble protein in Escherichia coli by twodimensional electrophoresis technology, the first phase is isoelectrofocusing, and the second electrophoresis is SDS-PAGE. The effect of sample handling, protein staining methods on the sample volume and other key factors and segments were discussed and studied comparatively. The more satisfactory two-dimensional electrophoresis maps could be gained through screening and optimization of experimental conditions. This Methods in our experiment has a high resolution and repeatability, which has laid a foundation for study of proteomics and been used successfully in undergraduate teaching experiment.

proteome; soluble protein; two dimensional electrophoresis; experiment teaching

2009-11-24

尹燕霞，硕士，实验师。