万古霉素手性固定相分离克伦特罗对映体

张丹丹 ,金 宏,赵文英,金 岩

(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

万古霉素手性固定相分离克伦特罗对映体

张丹丹＊,金 宏,赵文英,金 岩

(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

应用万古霉素手性固定相对克伦特罗对映体进行了分离,考察了洗脱模式、流动相组成、柱温等因素对分离的影响,并对其分离机制进行了探讨.最佳色谱条件为:甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.01∶0.01),流速1.0 mL/min,柱温20℃.在此条件下,克伦特罗对映体可实现基线分离,最大分离度可达2.67.克伦特罗对映体与固定相之间的离子相互作用是实现对映体分离的最主要分离机制.

万古霉素;手性固定相;克伦特罗;对映体;手性分离

随着医药学和生命科学的发展,人们逐渐发现药物对映异构体在药理、毒理和临床疗效等方面存在着较大的差异,因此药物对映体的拆分工作具有重要意义.克伦特罗是β2肾上腺受体激动剂,主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛[1].克伦特罗分子中含有一个手性中心(其结构式见图1),目前临床上应用的克伦特罗均为外消旋体,但研究表明,在临床上有效的一般为其(-)-异构体,而(+)-异构体则对疗效没有贡献[2].因此,对克伦特罗对映体进行拆分研究,建立快速、灵敏、分离性能好的测定方法是一个具有理论及实际意义的课题.目前,对该药物的拆分主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法.如宋雅茹等人将酰胺型手性固定相用于高效液相色谱拆分克仑特罗对映体[3];唐琴等人用Whelk-O1手性固定相成功拆分了克伦特罗对映体[4];黄可龙等人用毛细管电泳法以羟丙基-β-环糊精为手性添加剂拆分了克仑特罗对映体[5].但至今还没有关于利用万古霉素手性固定相对克仑特罗进行手性拆分的报道.本实验首次采用万古霉素手性固定相对克伦特罗对映体进行了分离,并从结构上探讨了手性分离的机制.万古霉素手性固定相的结构式如图2所示.

图1 克伦特罗的结构式Fig.1 Structure of clenbuterol

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Jasco UV-980高压输液泵,Jasco UV-975检测器(Jasco日本分光公司),IC 2001 plus型柱温箱,Anastar色谱工作站,U6K型进样阀(20μL定量环),DT-100A型分析天平,p HS-25型p H计,DL-180型超声波清洗机.

盐酸克伦特罗由青岛双鲸药业提供;甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯(天津市康科德科技有限公司);冰醋酸、三乙胺、硝酸铵均为特级纯(天津市博迪化工有限公司).

1.2 色谱条件

色谱柱:Chirobiotic V(150×4.6 mm I D,5μm)(Advanced Separation Technologies Inc,美国).最佳流动相:甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.01∶0.01).流速1.0 mL/min;紫外检测波长254 nm;进样量20μL.药物对照品用甲醇溶解,配制成浓度为1.0 g/L的供试液.

图2 万古霉素手性固定相的结构式Fig.2 Structure of vancomycin-based chiral stationary phase

2 结果与讨论

2.1 分离模式的选择

万古霉素手性固定相有正相、反相和新极性有机相三种分离模式.

在正相模式下,考察了两种流动相系统:正己烷/乙醇和正己烷/异丙醇,并通过改变流动相组成以求实现手性分离.令人失望的是,在此模式下,克伦特罗对映体在万古霉素手性固定相上不能实现分离.

在反相模式下,首先采用厂家建议的0.1%冰醋酸-三乙胺(p H 4.1)-20%甲醇为流动相,考察了克伦特罗保留行为和选择性受有机改性剂的种类(甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃等)和浓度(10%～70%),缓冲盐的性质(硝酸铵、醋酸铵)和p H值(4.0～7.0)的影响,但通过优化这些分离条件,克伦特罗对映体在万古霉素手性固定相上均不能实现分离.

在新极性有机相模式下,克伦特罗对映体可获得分离,最大分离度可达到2.67,最佳流动相为甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.01∶0.01).

2.2 缓冲溶液的选择

在新极性有机相模式下,考察了醋酸铵、硝酸铵和1%醋酸三乙胺缓冲系统对分离的影响,结果发现,克伦特罗在1%醋酸三乙胺缓冲系统中可以得到手性分离.

2.3 缓冲溶液的浓度和p H

以甲醇-冰醋酸-三乙胺系统作为流动相,考察了冰醋酸和三乙胺的浓度和比例对分离的影响.在万古霉素手性固定相上,当流动相中只含有冰醋酸而不含有三乙胺时,克伦特罗只能检测到一个变形的色谱峰,不能实现手性分离;在只含有三乙胺的流动相中,克伦特罗对映体可实现一定的分离,但峰形不佳;在三乙胺存在的前提下,冰醋酸的加入可以改善色谱峰的峰形和对称性,实验结果表明,两者体积比为1∶1时克伦特罗对映体的分离效果最佳.因此,本实验采用甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.1∶0.1)为起始流动相,考察了缓冲液成分(冰醋酸/三乙胺)的浓度对克伦特罗在万古霉素手性固定相上保留行为和对映体选择性的影响.随着冰醋酸/三乙胺的浓度从0.1%降低至0.02%或0.01%,克伦特罗的保留时间明显延长,分离效果显著提高;但当冰醋酸/三乙胺的浓度继续降低至0.005%时,克伦特罗的保留时间过长,色谱峰展宽,分离效果下降.具体数据见表1.确定甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.01∶0.01)为最佳流动相,此条件下克伦特罗对映体可实现基线分离,最大分离度可达到2.67,分离色谱图见图3.

表1 流动相组成对克伦特罗对映体分离的影响Table 1 Effect of mobile phase composition on the enantioseparation of clenbuterol

2.4 柱温的影响

柱温对分离度和保留时间有着重要的影响,以甲醇-冰醋酸-三乙胺(体积比100∶0.01∶0.01)为流动相,考察了克伦特罗对映体在10,20,30和40℃下的分离情况.实验结果表明,随着温度的升高,克伦特罗的保留时间和对映体选择性均随之降低,具体数据见表2.权衡分离度,保留时间及实际操作性,选取最佳分离温度为20℃.

2.5 分离机制的探讨

图3 克伦特罗对映体的色谱图Fig.3 Chromatogram of clenbuterol enantiomers

万古霉素分子中具有多种官能团和不对称中心,可与被分析物质产生多种作用,如疏水作用、包合作用、偶极-偶极作用,π-π诱导作用、氢键作用、空间位阻作用及范德华相互作用.克伦特罗的结构中具有苯环,羟基,卤素和氨基基团,可以与手性选择剂上相应的官能团发生相互作用从而实现手性分离.新极性有机相模式可以提升所有这些相互作用,因此在此模式下,克伦特罗对映体得到了在正相和反相模式下不能实现的分离效果.而在新极性有机相模式下,必须有三乙胺存在于流动相中才可实现克伦特罗对映体的分离,当流动相中同时含有三乙胺和冰醋酸时,分离效果最佳,这说明离子作用是此模式下对映体分离的最主要作用机制,而克伦特罗的手性分离是上述提到的各种相互作用的共同结果.

表2 温度对克伦特罗对映体分离的影响Table 2 The effects of temperature on the enantioseparation of clenbuterol

[1]孙定人,张石革,梁之江.国家临床新药集[M].北京:中国医药科技出版社,2001,9:358-359.

[2]Gausepohl C,Blaschke G.Stereoselective determination of clenbuterol in human urine by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr B:Biomed Sci A pplic,1998,713(2):443-446.

[3]宋雅茹,王德发,杨亦平,等.酰胺型手性固定相直接拆分克伦特罗对映体[J].色谱,2002,20(2):118-120.

[4]唐琴,宋航,付超,等.高效液相色谱手性固定相法拆分克伦特罗对映体[J].分析化学,2004,32(6):755-758.

[5]黄可龙,胡卫国,王蔚玲,等.高效毛细管电泳对克伦特罗对映体的分离及定量检测[J].分析科学学报,2007,23(1):9-12.

Enantioseparation of Clenbuterol by Vancomycin-Based Chiral Stationary Phase

ZHANG Dan-dan,J IN Hong,ZHAO Wen-ying,J IN Yan
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao266042,Shandong,China)

The enantiomers of clenbuterol were separated by using vancomycin-based chiral stationary phase.The effects of elution mode,composition of mobile phase and column temperature on separation efficiency were investigated.The separation mechanism was also explored.Results indicate that the best separation efficiency is achieved at a mobile phase(methanol-acetic acid-triethylamine,volume ratio 100∶0.01∶0.01)flow rate of 1.0 mL/min and temperature of 20℃.It is feasible to realize baseline separation of the enantiomers of clenbuterol under the optimal conditions,with the maximum resolution factor being 2.67.Besides,ionic interaction between the vancomycin-based chiral stationary phase and the enantiomers of clenbuterol is responsible for the chiral separation of the enantiomers.

vancomycin;chiral stationary phase;clenbuterol;enantiomer;chiral separation

O 657.7

A

1008-1011(2010)05-0051-03

2010-06-18.

青岛科技大学引进人才科研启动基金资助项目(qust0022400).

张丹丹(1978-),女,副教授,博士,主要从事手性药物的分离分析及其机制研究.E-mail:dandanzhang625@hotmail.com.