6-羟基-多溴联苯醚 47对 A549细胞抗氧化系统的影响

赵金玉, 钟玉芳, 王艺陪, 王杨君, 安 静, 盛国英, 傅家谟

(上海大学环境与化学工程学院环境污染与健康研究所,上海 200444)

6-羟基-多溴联苯醚 47对 A549细胞抗氧化系统的影响

赵金玉, 钟玉芳, 王艺陪, 王杨君, 安 静, 盛国英, 傅家谟

(上海大学环境与化学工程学院环境污染与健康研究所,上海 200444)

多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一类具有内分泌干扰和神经毒性的持久性有机污染物,但对其代谢产物的毒性研究还较少.从细胞毒性和氧化应激的角度,探讨 2,2′,4,4′-四溴联苯醚 (2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)的羟基代谢物 6-羟基 -多溴联苯醚 47(6-hydroxylated-2,2′,4,4′-tetrapolybrominated diphenyl ethers,6-OH-BDE47)对人肺癌细胞系 A549的作用.研究结果发现,6-OH-BDE47对 A549细胞具有明显的细胞毒性,随着染毒剂量增加和时间延长,A549细胞存活率逐渐下降.急性染毒实验证实,6-OH-BDE47对 A 549细胞的氧化应激系统有严重的影响.当细胞培养体系中 6-OH-BDE47浓度≥0.5μmol/L时,24 h急性暴露能诱导A549细胞的总超氧化物歧化酶 (total superoxide dismutase,T-SOD)活力升高 1.03倍以上;而 6-OH-BDE47浓度≥2.0 μmol/L时,还原性谷胱甘肽 (reduced the glutathione,GSH)含量减少 71.2%.由此可见,6-OH-BDE47有一定的细胞毒性,能刺激A549细胞发生氧化应激,诱导抗氧化酶升高和内源性还原剂耗竭.

多溴联苯醚;持久性有机污染物;氧化应激;多溴联苯醚 47

Abstract:Polybrominated diphenyl ethers(PBDEs),a classof persistentorganic pollutants,wereproved to be endocrine disrup tors and neurotoxic agents.However,there are few reports about the toxic effectsof their hydroxylated metabolites.Our objectivewas to investigate the cytotoxicity of 6-hydroxylated-2,2′,4,4′-tetrapolybrominated diphenyl ethers(6-OH-BDE47)and its effectson anti-oxidative systems in A549 cells after acute exposure.The results show that6-OH-BDE47 hasobviouscytotoxicity,and the A549 cell survival gradually decrease after exposure in a dose-and time-dependent manner. Acute exposure experiment confirmed that the oxidative stress system of A549 cells was seriously impaired by 6-OHBDE47.When the final concentration of 6-OH-BDE47 in culture medium was higher than 0.5μmol/L,the total superoxide dismutase(T-SOD)content in treatment group cells increased by 1.03 times compared to the control group cells;and≥2.0μmol/L of 6-OH-BDE47 reduced the glutathione content by 71.2%.These results suggest that 6-OH-BDE47 has certain cytotoxicity on A 549 cells and can impair oxidative stress responses as evidenced by increased SOD activity and decreased GSH.

Key words:polybrominated diphenyl ethers;persistent organic pollutants;oxidative stress;BDE47

多溴联苯醚 (polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一类广泛应用于电子、化工、建材等领域的溴代阻燃剂,具有环境稳定性和亲脂性等特征,容易在环境中积累并通过食物链富集.随着 PBDEs应用的增长,其对生态环境的危害也日益凸显.有研究预测,在未来的 15～30年内,PBDEs将成为主要的环境持久性有机污染物.目前,在许多环境介质和生物体内均可以检测到 PBDEs的存在,如大气、水、沉积物、鱼类、淡水贝类、母乳等[1-5],人体样品中以BDE47,BDE99,BDE153和 BDE183为主要同系物[6-7].PBDEs有两种类型的代谢产物,即羟基化PBDEs和甲氧基 PBDEs,在人体内也检测到了这两类代谢物[8].研究表明,PBDEs具有内分泌干扰效应、神经发育毒性等特性[9-11].目前,对 PBDEs代谢产物的毒性研究还较少,本实验选用 BDE-47的羟基代谢物 6-OH-BDE47,观察其对人肺癌细胞 A549的细胞毒性以及氧化应激相关的超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽 GSH的影响.

1 试剂与仪器

1.1 材料与试剂

人肺癌细胞系 A 549,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;噻唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT),购自上海前尘生物公司;二甲基亚砜 (DMSO),美国 Amresco公司生产;超氧化物歧化酶 SOD检测试剂盒和谷胱甘肽 GSH检测试剂盒,购自南京建成生物工程公司;其余试剂为国产分析纯.

1.2 仪器

实验仪器有 Thermo Labsystems MK3酶标仪、Thermo全波长荧光 /比色扫描读数仪、国产恒温水浴锅等.

2 实验方法

2.1 实验分组与染毒处理

本实验设 1个溶剂对照组和 3个剂量 6-OHBDE47染毒组.溶剂对照组用体积分数为 0.1%的DMSO处理,6-OH-BDE47溶于 DMSO,分 0.1,0.5和 2.0μmol/L 3个浓度组.

2.2 测定细胞存活率的M TT试验

MTT试验是通过测定活细胞代谢噻唑蓝的蓝紫色产物的量来反映细胞存活率或细胞活力的细胞毒性检测方法,并通过该试验筛选受试物的作用时间.称取一定量的MTT溶于磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline,PBS)中 ,配成 5 mg/mL MTT/PBS溶液,0.22μm滤膜过滤后于 4℃避光保存.取对数生长期的 A549细胞接种于 4块 96孔培养板中,每孔2×103个细胞,每组 5个平行样.培养过夜后换无血清培养基,分别加入体积分数为 0.1%的 DMSO,终浓度分别为 0.1,0.5和 2.0μmol/L的 6-OH-BDE47(DMSO浓度控制在 0.1%).分别染毒 6,24,48,72 h后加入终浓度 0.5 mg/mL的MTT,37℃孵育4 h,吸去上清后加 DMSO溶解,用酶标仪于 492 nm处测其光密度.

2.3 SOD活力检测

SOD是细胞启动氧化应激效应和清除超氧阴离子的重要角色.本实验采用黄嘌呤氧化酶法,通过测定超氧阴离子 O2-氧化羟胺生成的亚硝酸盐含量可反映 SOD的活力.高等动物细胞内有两种 SOD,即铜锌 SOD(CuZn-SOD)和锰 SOD(Mn-SOD).本实验将对细胞内总 SOD(T-SOD)和分型 SOD分别进行检测,以观察不同亚型 SOD在 6-OH-BDE47氧化应激效应中的作用.取对数生长期的 A549细胞,接种于 75 mL细胞培养瓶,每瓶约 1×106个细胞.细胞培养过夜后按上述分组染毒,每组 3个平行样,根据MTT试验筛选的染毒时间,染毒 24 h后收获细胞,超声破碎,其余具体操作步骤按说明书进行.SOD活力 (U/mg pro)=(OD对照管-OD测定管)×反应总体积 /(OD对照管×50% ×取样量 ×待测样本蛋白含量).

2.4 GSH含量检测

GSH是抗氧化系统中含量丰富的抗氧化剂,测定其含量可反映细胞抗氧化水平.利用二硫代二硝基苯甲酸与 GSH上的巯基反应,生成的黄色化合物可进行比色定量.取对数生长期的 A549细胞,接种于 75 mL细胞培养瓶,每瓶约 1×106个细胞.细胞培养过夜后按上述分组染毒,24 h后收获细胞,超声破碎,其余具体操作步骤按说明书进行.GSH含量(mg/g pro)=(OD测定管-OD空白管) ×标准管 GSH浓度 ×GSH分子量 307/[(OD标准管-OD空白管)×待测样本蛋白含量].

2.5 Bradford法定量蛋白

参照文献[12]中的方法进行.

2.6 统计学方法

本研究采用 SPSS10.0进行 One-way ANOVA分析,均数以 x-±s表示.

3 实验结果

3.1 6-OH-BDE47对 A549细胞存活率的影响

由图1可见,A 549细胞的存活率与 6-OHBDE47之间存在着明显的剂量和时间效应关系.低浓度 (0.1μmol/L)6-OH-BDE47作用 24 h后,细胞仍保持 90%的存活率 (后续实验选择 24 h作为染毒时间),72 h后降至 80%;而高浓度 (2.0μmol/L)6-OH-BDE47作用 6 h后,细胞的存活率下降至 80%左右,72 h后只有 30%的细胞存活.

图1 6-OH-BDE47对 A549细胞存活率的影响Fig.1 Survival rate of A549 cells after treatment by 6-OH-BDE47

3.2 6-OH-BDE47对 A 549 SOD活力的影响

由表 1可见,0.1μmol/L组与对照组细胞 TSOD活力无统计学差异,而 0.5μmol/L组和 2.0 μmol/L组细胞的 T-SOD活力与对照组相比分别升高了 1.03倍和 1.15倍,差异有统计学意义.Mn-SOD活力在各染毒组均表现出升高的趋势,0.1μmol/L组升高 47.1%,0.5μmol/L组升高 2倍,2.0μmol/L处理组升高2.96倍,但仅2.0μmol/L组与对照组的差异有统计学意义.

表 1 不同浓度 6-OH-BDE47对 A549总 SOD活力和分型SOD活力的影响Table 1 Changes of T-SOD,CuZn-SOD and M n-SOD activities in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47(U/m g pro,x—±s,n=3)

3.3 6-OH-BDE47对 A549 GSH含量的影响

由表 2可见,随着染毒浓度的升高,各处理组GSH含量逐渐下降,0.1,0.5和 2.0μmol/L组细胞中GSH含量分别下降 21.6%,34.8%和 71.2%,其中2.0μmol/L组与对照组的差异有统计学意义.

表 2 不同浓度 6-OH-BDE47对 A549 GSH含量的影响Table 2 Changes of GSH concentration in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47

表 2 不同浓度 6-OH-BDE47对 A549 GSH含量的影响Table 2 Changes of GSH concentration in A549 cells after the treatment by d ifferent doses of 6-OH-BDE47

注:与对照组相比,＊P<0.05

组别 对照组 0.1μmol/L组0.5μmol/L组2.0μmol/L组GSH含量 8.06±0.36 6.31±0.46 5.26±2.94 2.32±1.90＊

4 结 束 语

在生理状态下,细胞会产生一定量的自由基,同时细胞内的抗氧化系统维持在一定水平以清除这些自由基,避免其与核酸、蛋白等生物大分子反应而损伤细胞.在外来刺激作用下,细胞会产生大量自由基,此时抗氧化系统也会被调动起来,其中 SOD作为一种金属酶可催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应,从而清除氧自由基,随着 O2-的产生量增加,SOD会相应大量表达.GSH作为抗氧化系统中含量丰富的抗氧化剂,参与许多氧化物质如 H2O2,ROOH等的解毒过程.从本工作的研究结果可见,在高于 0.5μmol/L 6-OH-BDE47作用下,A549细胞SOD活力可增加 2～3倍,这说明 6-OH-BDE47可能使细胞产生大量O2-,从而诱导 SOD的大量表达,且主要是Mn-SOD含量升高;同时,2.0μmol/L 6-OHBDE47使细胞产生了相当数量的 H2O2,ROOH等自由基,促进 GSH的消耗而使其含量下降.氧化应激效应可能导致细胞的损伤甚至死亡,本研究观察到随着 6-OH-BDE47剂量的增加,细胞存活率有逐渐下降的趋势,推测与细胞氧化应激水平有一定关系,但其具体机理有待进一步研究.

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(编辑:刘志强)

Effects of 6-hydroxylated Polybrom inated D iphenyl Ether s-47 on Anti-Oxidative System s of A549 Cells

ZHAO Jin-yu, ZHONG Yu-fang, WANG Yi-pei, WANG Yang-jun,
AN Jing, SHENG Guo-ying, FU Jia-mo(Institute of Environmental Pollution and Health,School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China)

R 994

A

1007-2861(2010)03-0302-04

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.03.017

2009-02-13

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2008CB418205);上海市重点学科建设资助项目(S30109)

安 静 (1976～),女,副研究员,博士,研究方向为环境毒理学.E-mail:peace74839@shu.edu.cn