谷氨酸棒杆菌SYPS-062合成L-丝氨酸的代谢通量分析

张晓梅，窦文芳，许泓瑜，许正宏,2

1 江南大学医药学院 制药工程研究室，无锡 214122

2 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

细胞工厂的代谢网络及调控

谷氨酸棒杆菌SYPS-062合成L-丝氨酸的代谢通量分析

张晓梅1，窦文芳1，许泓瑜1，许正宏1,2

1 江南大学医药学院 制药工程研究室，无锡 214122

2 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料直接产 L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicumSYPS-062为研究对象，考察了一碳单元循环中的辅因子—叶酸和维生素B12对菌株生长、蔗糖消耗及L-丝氨酸生成的影响，同时对处于对数生长期的菌株进行了代谢流量分析。结果发现，添加扰动因子叶酸和维生素B12对磷酸戊糖途径(HMP) 碳流影响较大，碳源主要用于细胞生长及合成能量，而流向目的产物L-丝氨酸的碳流减少。同时在添加维生素B12时，增大了G3P节点的L-丝氨酸合成途径的分流比，但造成三羧酸循环 (TCA) 的流量不足，需要大量回补，从而限制了产物合成速率的进一步提高。

谷氨酸棒杆菌，L-丝氨酸，一碳单元，代谢通量分析

Abstract:Corynebacterium glutamicumSYPS-062 was an L-serine producing strain stored at our lab and could produce L-serine directly from sugar. We studied the effects of cofactors in one carbon unit metabolism-folate and VB12on the cell growth, sucrose consumption and L-serine production by SYPS-062. In the same time, the metabolic flux distribution was determined in different conditions. The supplementation of folate or VB12enhanced the cell growth, energy synthesis, and finally increased the flux of pentose phosphate pathway (HMP), whereas the carbon flux to L-serine was decreased. The addition of VB12not only increased the ratio of L-serine synthesis pathway on G3P joint, but also caused the insufficiency of tricarboxylic acid cycle (TCA ) flux, which needed more anaplerotic reaction flux to replenish TCA cycle, that was an important limiting factor for the further increasing of the L-serine productivity.

Keywords:Corynebacterium glutamicum, L-serine, one carbon units, metabolic flux analysis

L-丝氨酸是生物体内一种重要的中间代谢产物，广泛应用于医药、食品、化妆品领域[1]。L-丝氨酸的生产方法主要有蛋白水解法、化学合成法、酶法和发酵法[2]。微生物和酶法均以甘氨酸及甘油酸盐为前体，而直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的报道较为少见。Petra等最近分析研究了谷氨酸棒杆菌中 L-丝氨酸代谢途径中的一些关键酶，首次构建了产 L-丝氨酸的基因工程菌，产量为86 mmol/L[3-5]；随后为解决遗传信息易丢失的问题，又构建了叶酸缺陷型的基因工程菌C. glutamicum△pabABC△sdaA(pserACB)，L-丝氨酸产量可达346 mmol/L[6]。魏东等[7]对一株重组黄色短杆菌进行诱变改良，筛选获得色氨酸营养缺陷型的高产突变株，该菌株能以糖质原料作为唯一碳源合成L-丝氨酸，但尚未见进一步的研究报道。作者所在课题组从自然界中筛选得到一株能直接利用糖质原料发酵生产 L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌C. glutamicumSYPS-062，并考察分析了6种维生素对L-丝氨酸积累的影响[8]，而野生型谷氨酸棒杆菌直接利用糖质原料合成L-丝氨酸尚未见文献报道。

近年来利用代谢通量分析的手段使目的氨基酸大量积累的例子在国内外已有许多报道，张克旭等[9]建立了谷氨酸棒杆菌合成 L-色氨酸 (L-Try) 的代谢流量平衡模型，线性规划得到L-色氨酸理想代谢流分布。Tomokazu等[10]对2株能够合成谷氨酸的谷氨酸棒杆菌的代谢流作了比较，发现通过降低 α-酮戊二酸脱氢酶活性来提高谷氨酸产量效果明显。Hua等[11]分析了不同溶氧水平对谷氨酸棒杆菌积累L-赖氨酸的影响。但到目前尚未见 L-丝氨酸代谢通量方面的研究，作者课题组前期的研究发现一碳循环中的辅因子叶酸和维生素 B12对 L-丝氨酸生成的影响非常显著，同时对生物量的积累有较大的促进作用，因此本研究选择叶酸和维生素B12作为扰动因子，在不同条件下对C. glutamicumSYPS-062的L-丝氨酸代谢网络进行通量分析，定量研究该菌株细胞内各代谢途径之间的关系，具体分析了限制L-丝氨酸进一步积累的因素，为下一步的菌种改良和发酵工艺优化控制等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

C. glutamicumSYPS-062为本研究室分离保藏，能利用糖质原料直接合成L-丝氨酸。

1.2 培养基

保藏培养基 (g/L)：牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 3，琼脂20。

种子培养基 (g/L)：玉米浆20，豆饼水解液20，葡萄糖 30，KH2PO41，尿素 1.5，MgSO40.5，(NH4)2SO420，pH 7.0。

发酵培养基 (g/L)：蔗糖 60，(NH4)2SO430，KH2PO40.3，MgSO40.5，MnSO40.02，FeSO40.02，CaCO320，pH7.0。VB1、VB2、VB6、VB12、生物素和叶酸根据实验需要添加。

1.3 培养方法

从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基(30 mL/250 mL锥形瓶)，在30℃转速110 r/min (往复式摇床) 下培养24 h后，以5% (V/V) 接种量接入发酵培养基。摇瓶发酵装液量为20 mL/250 mL锥形瓶，在30℃转速110 r/min (往复式摇床) 下发酵96 h。

1.4 分析方法

1.4.1生物量的测定

发酵液用0.25 mol/L的盐酸稀释至适当倍数，测定562 nm处的光密度，按照1OD=0.27 g/L DCW，换算为菌体干重。

1.4.2L-丝氨酸和蔗糖浓度的测定

L-丝氨酸浓度采用安捷伦 1 100液相色谱仪测定。色谱柱：HypersilODS-C18 4 mm×125 mm；柱温：40℃；体积流量：1.0 mL/min；检测器：荧光检测器；激发波长：340 nm；发射波长：450 nm；流动相：20 mmol/L醋酸钠∶乙醇∶乙腈= 1∶2∶2 (V/V)。蔗糖浓度采用间苯二酚法测定[12]。

1.4.3有机酸含量测定

HPLC分析法(HP1100)，色谱条件：ZORBAX SB C18，流动相0.1 mol/L磷酸-磷酸二氢钾缓冲液，进样量5 μL，紫外检测波长为210 nm。

接种后和发酵结束后分别测定每个摇瓶的重量。分别将测得的浓度换算为恢复成原重后的浓度(文中出现的均为换算后的浓度)。

1.5C. glutamicum的L-丝氨酸代谢网络的构建

综合文献分析[13]，本研究基于以下原则或假设建立代谢网络：

1) 早期的许多研究都报道C. glutamicum及其相关菌株胞内含有完整的EMP和TCA循环及磷酸戊糖途径 (PP途径)[14]。Vallino等的研究表明，TCA循环是谷氨酸菌属发酵过程中的主要氧化途径[15]；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应是TCA循环的主要回补反应。基于此，作者在构建C. glutamicumSYPS-062的代谢网络时未考虑乙醛酸途径；以葡萄糖为底物的谷氨酸细菌胞内未发现 ED途径[16]，因此本代谢网络未考虑ED途径。

2) 由于利用菌株SYPS-062生产L-丝氨酸属于偶联型发酵过程，因此选择在L-丝氨酸快速合成的阶段作分析，在该阶段细胞同样增殖迅速，因此生物量的积累是不可忽略的；细胞组成采用Vallino and Stephanopoulos测得的数据：C 47.6%；H 6.46%；O 31.0%；N 11.8%；灰分3.02%。

3) NADPH、NADH、ATP供需平衡，即反应途径中消耗的与EMP途径、HMP 途径、TCA循环产生的总数相等。

4) 按照固定比例进行的反应以及无分支点的中间反应，可简化为一个反应方程。

5) 于不同发酵阶段对可能的有机酸代谢副产物如乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、丁酸及甲酸进行了检测 (数据未列出)，发现在整个发酵过程中，始终未检测到乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、甲酸，因此，在代谢网络的构建中不考虑这几种物质的合成途径，丙酮酸、α-酮戊二酸和柠檬酸在细胞外有微量积累，但在L-丝氨酸大量合成时期基本不变化，因此将这3种物质视为中间代谢产物，不向胞外积累。

1.6C. glutamicum的 L-丝氨酸代谢流平衡模型的建立

根据文献报道以及以上分析，L-丝氨酸生物合成的代谢网络见图 1，各步反应的化学计量方程见附录。

1.7 代谢流研究的数学基础和代谢方程组的求解

代谢网络分析理论的基本原理如下：1) 根据细胞生化特征确定约束条件。2) 准稳态假设(Pseudo-steady-state)：假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，即其浓度变化速率为 0。3) 通过测定胞外代谢产物的积累速率计算发酵过程代谢流量，构建代谢网络。

对于代谢网络中的每个组分，都符合质量守恒定律，即组分的积累速率等于该组分的生成减去消耗速率，其数学表达式为：

式中，xj(t)：第j步反应的反应速率[mmol/(L·h)]；xk(t)：第k步反应的反应速率[mmol/(L·h)]；αj：第j步反应的反应计量系数；αk：第k步反应的反应计量系数；ri(t)：中间代谢物i的积累速率[mmol/(L·h)]。

将代谢网络中涉及的m个组分的物料平衡式联立，就得到如下代谢网络平衡矩阵：

式 (2) 中的A是n×k阶的代谢反应行列矩阵，r是k×1阶的反应速度的向量。其中n表示简化后代谢网络的节点个数；而k则表示反应速度的总个数，它是简化代谢网络模型的反应式个数与着眼物质速度式的个数之和。如果k个总反应速度中有m个是在线可测的，对应的可测速度向量为rm，而其余不可测速度向量为rc，则式(2)可以分解成下列形式：

这样，不可测速度向量为rc就可以利用式(4)，由可测速度向量rm和代谢反应行列矩阵A来进行推定：

r的元素列于附录，由r元素可得节点数为 34个，方程数26个，方程自由度为8，需要测得8个速率方可确定代谢网络中的流量分布，在L-丝氨酸的发酵过程中，离线检测的胞外代谢物为蔗糖、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、生物量的浓度，对时间微分得到各物质的积累速率，即rm，将这些速率带入式 (4)，使用 PC-Matlab软件对进行矩阵运算，可求得代谢流分布。

图1C. glutamicumSYPS-062 L-丝氨酸代谢网络模型Fig.1 The Metabolic network model of L-serine inC. glutamicumSYPS-062. Suc: sucrose; Suc-6-P: sucrose-6-phosphate; G-6-P:glucose-6-phosphate; F-6-P: fructose-6-phosphate; GAP: glyceradehyde-3-phosphate; G3P: 3-phosphoglycerate; PEP:phosphoenolpyruvate; Pyr: pyruvate; AccoA: acetyl coenzyme A; IsoCit: isocitrate; α-KG: α-ketoglutarate; OAA: oxaloacetate; Asp:L-aspartate; Met: L-methionine; Pro: L-proline; Val: valine; CHO: chorismic acid; Phe: L-phenylalanine; ser(i): L-serine(intracellular);ser(e): L-serine(extracellular); Gly: glycine; THF: tetrahydrofolic acid; METHF: methylenetetrahydrofolic acid; MYTHF:methyltetrahydrofolic acid; ser(i): L-serine(intracellular); ser(e): L-serine(extracellular); Glu: glutamate; Pro: praline; NADPH:nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NADH; nicotinamide adenine dinucleotide-re-duced; NADP: nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NAD: nicotinamide-adenine dinucleotide; ATP: adenosine triphosphate; ADP: adenosine diphosphate; E4P:erythrose-4-phosphate; R5P: ribose-5-phosphate; X5P: xylulose-5-phosphate; Ribu5P: ribulose-5-phosphate.

2 结果与分析

2.1C. glutamicumSYPS-062在不同条件下发酵过程比较

作者课题组前期研究表明，叶酸和 VB12对C. glutamicumSYPS-062发酵影响最为显著，对L-丝氨酸积累有很大的促进作用[8]，因此选择单独添加40 μg/L叶酸和0.4 μg/L VB12作为扰动因子，考察其对L-丝氨酸代谢网络的影响，深入剖析这两种维生素的影响机制。

图2为不同条件下菌株C. glutamicumSYPS-062的发酵过程参数，从图2可以看出添加叶酸和VB12对菌体生长及L-丝氨酸积累的显著促进作用。其中0～48 h为延滞期，在这几种条件下菌体生长都非常缓慢，糖耗也非常少，仅为3 g/L左右；48～96 h为细胞的对数生长期，此时菌体增殖的速率达到最大值，L-丝氨酸的积累也较迅速，叶酸和VB12也表现出对菌体生长及L-丝氨酸积累的显著促进作用，其中VB12的促进作用非常显著，叶酸次之。之后进入稳定期，菌体增长速度明显下降，而对于L-丝氨酸的积累，则在初始条件下，仍有缓慢的增加，但在分别添加两种扰动的情况下，L-丝氨酸的积累量基本不变，或有一定的下降。这个结果表明，添加这两种扰动，不但能够提高产量，而且会在一定程度上提前结束发酵，缩短发酵周期。

在不同的培养条件下，蔗糖的消耗情况总趋势大体一致，但消耗速度受扰动因子的影响很大。图2D表示了产物 L-丝氨酸对蔗糖转化率也同样受到扰动的影响，结果显示随着发酵时间的延长，转化率不断升高，但初始条件下，增长幅度较添加扰动的情况较小。结合以上分析，选择在L-丝氨酸积累速度最快的细胞对数生长期后期 (72～88 h) 进行代谢通量分析。

2.2C. glutamicumSYPS-062胞内的代谢流量分析

细胞代谢是由一个受到精密调控而又彼此协调的代谢网络来完成的，通常情况下，细胞对不同的环境条件会有不同的反应，通过自身协调来使细胞代谢尽可能维持最优的资源配置。表 1比较了在不同条件下C. glutamicumSYPS-062发酵72 ～88 h的碳代谢流通量分配。从表 1可以看出，这两种扰动改变了细胞内的代谢网络流量分布，即产生了有效的刺激。以下对代谢网络分布作具体分析。

2.2.1C. glutamicum SYPS-062在不同条件下HMP途径的流量分配

磷酸戊糖途径 (HMP途径) 是合成细胞物质的重要途径，对SYPS-062的代谢网络模型而言，HMP途径具有3方面的作用：1) 合成细胞物质，在该模型中，5-磷酸核糖、4-磷酸赤藓糖都是对生物量积累贡献较大的物质；2) 合成还原力，以供细胞合成产物，积累细胞物质；3) 合成该菌株发酵过程中的重要的代谢副产物脯氨酸。结果显示 HMP(r13) 在初始条件下分流较添加扰动的情况分流少，即体现出在该条件下，细胞繁殖不活跃，生长不旺盛，对碳流需求不大。而在添加扰动的情况下，尤其是添加VB12，细胞增殖迅速，HMP途径的流量增大 (r13=64)，这个结果再次证明了叶酸和 VB12对促进细胞生长方面的有效影响。

图2 不同发酵条件下的参数曲线Fig.2 The parametric curves in different fermentation condition.

表1 不同条件对C. glutamicumSYPS-062中碳代谢流量的影响Table 1 Effect of different condition on the distribution of carbon flux inC. glutamicumSYPS-062

2.2.2磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 节点流量分析

PEP在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC) 的催化下转化为草酰乙酸 (OAA) (r12)，这个反应在C.glutamicum的代谢过程中也占有极其重要的地位，因为它是该类细菌在较低碳源浓度的培养基上生长时的唯一一条磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应(Anaplerotic reaction，r12)，即碳流较少时的唯一一条进入TCA循环的回补途径，在3种不同条件下，PEP节点流量分布如图3所示。

在初始条件下，PEP回补途径的流量最少，而添加VB12时最大，这个结果体现了添加扰动 (尤其是VB12) 促进L-丝氨酸积累，提高生物量的合成，从而导致了碳流在进入TCA循环之前被大量分流，TCA循环碳流不足，需要通过大量回补途径补充碳流。这个结果也可从TCA循环中r11的数据体现出来，在添加 VB12的情况下，该步反应的流量仅为14.4，而初始条件流量为151.7。如果进一步增大生物量积累速度，产物积累速度，则会导致TCA循环严重不足，限制正常的生理活动，因此，TCA循环碳流不足成为进一步提高产量的瓶颈因素。

图3 不同发酵条件下PEP节点代谢流量分布情况Fig 3 Metabolic flux distribution of PEP node in different fermentation condition.

2.2.33-磷酸甘油酸 (G3P) 节点流量分析

G3P节点是 L-丝氨酸合成途径中第一个反应物，该节点的分流比在很大程度上体现了单位底物L-丝氨酸的合成效率。由图 4知，在初始条件下，ser/G3P的分流比 (r18/r5) 为 11%，添加叶酸和VB12的情况下，分别为14%和22%，这个结果体现出VB12对G3P节点流量的重新分配非常有效，而叶酸相比较对该节点影响较小。因此，叶酸和VB12虽然都促进L-丝氨酸发酵，但作用机理是不同的。

图4 不同发酵条件下G3P节点代谢流量的分布情况Fig.4 Metabolic flux distribution of G3P node in different fermentation condition.

2.2.4C. glutamicum SYPS-062在不同条件下合成能量分析

C. glutamicumSYPS-062代谢网络中反应33中的ATP为网络中正常进行时所需要另外合成的以补充细胞生理代谢的ATP，由表2可见，ATP通量与L-丝氨酸的积累呈负相关，ATP通量高时，L-丝氨酸合成通量低；反之，ATP通量低时，L-丝氨酸合成通量则高。这个结果体现了在添加扰动的情况下，尤其是添加VB12对能量合成有促进作用，即细胞不但加速生长，快速合成产物L-丝氨酸，并且通过正常的自身代谢产生了较多的能量，以维持细胞正常的生理代谢活动，导致所需要另外合成的能量减少。

表2 不同条件下L-丝氨酸合成通量与ATP通量的关系Table 2 Relationship between L-serine production and biomass flux and ATP generation under different conditions

2.2.5C. glutamicum SYPS-062不同条件下合成的副产物的比较

由表 3可见，L-脯氨酸是合成速率最大的副产物，L-蛋氨酸次之，如能从遗传角度或发酵控制方面使副产物生成减少，可以达到代谢流迁移的目的，从而增大目标产物L-丝氨酸的积累。这几种副产物中，甘氨酸与L-丝氨酸代谢关系密切，甘氨酸是L-丝氨酸的下一级代谢产物，其流量随着L-丝氨酸合成流量的增大而增大是显而易见的，但添加叶酸虽然L-丝氨酸的合成流量没有达到最大值，但甘氨酸的合成速率达到最大值，这是因为叶酸是该反应的辅因子，对这步转化有一定的促进作用。

表3 不同发酵条件对副产物合成的影响Table 3 Synthesis rate of byproducts under different conditions

2.2.6C. glutamicum SYPS-062在不同条件下一碳循环的探讨

一碳循环在微生物体内非常重要，参与许多氨基酸、核酸、脂类的合成，对细胞生理行为影响非常大。在本模型中，由于目标产物L-丝氨酸是一碳单元的前体，是微生物体内重要的一碳单元的来源，所以构建了一碳单元的部分循环路径，即通过r29，L-丝氨酸降解为甘氨酸和一碳单元，再由四氢叶酸(THF) 作为载体携带一碳单元 (r30)，生成甲叉四氢叶酸 (METHF) (r31)，后者被氧化为甲基四氢叶酸(MYTHF) 后释放出一碳单元。本模型中，包括一个重要的需要一碳的反应，即 r24：由天门冬氨酸(Asp) 生成甲硫氨酸 (Met)。虽然由于模型具有一定的简化，不能囊括所有一碳单元参与的反应，但单就目前这两个生成及消耗一碳的反应来看，仍然具有一定的规律性：即在初始条件下，生成的一碳单元的流量 (r30) 明显较少，添加扰动后，生成一碳的流量显著提高，虽然不能对生成甲硫氨酸的流量(r27) 和 MYTHF释放一碳的途径作定量的关系描述，但添加扰动同样使甲硫氨酸的合成速率显著提高。尤其添加VB12时，达到最大值，这是由于VB12是生成甲硫氨酸的过程中甲基转移酶的辅因子，会促进一碳单元的转移与利用。

3 讨论

采用代谢网络分析方法对C. glutamicumSYPS-062进行研究表明，扰动因子叶酸和 VB12影响了HMP途径的分流，更多的碳流流入HMP途径产生更多的能量及细胞物质，导致了细胞生长旺盛，增殖迅速，同时使流向目的产物L-丝氨酸的分流减少。何宁等[17]对利用谷氨酸棒杆菌生产生物絮凝剂REA-11的代谢网络模型进行通量分析，结果与本研究一致。

对 G3P节点分析得到 VB12可以显著提高 L-丝氨酸合成途径的分流比，而叶酸对该节点分流比的提高较小，说明虽然这两种辅因子都可以提高L-丝氨酸合成途径的流量。但通过对PEP节点的比较分析发现，添加VB12时，由于大量碳流进入L-丝氨酸合成途径，同时生物量也大量积累，致使TCA循环中碳流不足，r11流量仅为14.4，需要大量回补，已经限制了进一步的提高合成L-丝氨酸的速度，成为进一步提高产量的一个瓶颈因素。

由于在对数生长中后期产物合成速率达到最大值，此时培养基的蔗糖已有很大程度上的消耗 (图2C)，因此可以考虑在后期采用补糖策略，提供充足的碳源，一定程度上缓解这种矛盾。同时还应看到，虽然L-丝氨酸属于I型发酵，产物合成与菌体生长有密切的关系，但细胞的快速生长繁殖对碳流的消耗同样很大，寻求高产量和高细胞浓度之间的平衡点，提高单位菌体的产酸率是进一步提高产量所需要慎重考虑的。

一碳循环是微生物的一个重要的循环，并且与L-丝氨酸的积累关系密切，本模型对一碳循环作了较大的简化，得知在添加叶酸和VB12的情况下，一碳单元利用更充分、有效，尤其在添加VB12时，对HMP途径和合成甲硫氨酸这两个需要一碳的反应有较显著的促进。关于一碳循环更多的信息，没有办法从本模型中分析得到，有待于进一步的研究。

附录：化学计量学方程式

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Metabolic flux analysis of L-serine synthesis byCorynebacterium glutamicumSYPS-062

Xiaomei Zhang1, Wenfang Dou1, Hongyu Xu1, and Zhenghong Xu1,2

1Laboratory of Pharmaceutical Engineering,School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China

Received:May 26, 2010;Accepted:August 26, 2010

Supported by:State Key Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707804), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020104), Program for New Century Excellent Talents in University of China (No. NCET-07-0380).

Corresponding author:Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@163.com

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2007CB707804)，国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2006AA020104)，教育部新世纪优秀人才支持计划 (No. NCET-07-0380) 资助。