丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统

董红军，张延平，李寅

中国科学院微生物研究所，北京 100101

细胞工厂的构建技术

丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统

董红军，张延平，李寅

中国科学院微生物研究所，北京 100101

丙酮丁醇梭菌是极具潜力的替代燃料——生物丁醇的合成菌，受到各国研究者的普遍关注。丙酮丁醇梭菌菌株改造是生物丁醇产业化进程中的一项重要工作，其中遗传操作是核心内容之一。以下对丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统的发展历史、种类和原理进行了综述，分析了目前几种遗传操作系统的局限性，并对其发展进行了展望。

丙酮丁醇梭菌，丁醇，菌株改造，遗传操作系统

Abstract:Clostridium acetobutylicum, a biofuel-butanol producer, has attracted worldwide interests. Strain improvement is important for the process of biobutanol industrialization where efficient genetic modification systems are essential. In this review,the history of genetic modification systems ofC. acetobutylicumwas introduced, and the types and principles of these systems and their disadvantages are summarized and analysed. The development of updated genetic modification systems forC. acetobutylicumis also proposed.

Keywords:Clostridium acetobutylicum, butanol, strain improvement, genetic modification systems

丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过140万t。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道、不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且与汽油有很好的混合性。

生产丁醇有两种方式，一种是通过化工方法从石油中提炼。这种方法是目前市场上丁醇的主要来源。但随着石油作为不可再生资源，储备量急剧减少，且价格节节攀高，生物法生产丁醇作为石化法生产的替代方式受到越来越多的关注。产丁醇的微生物包括丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum、拜氏梭菌C. beijerinckii、C. saccharoperbutylacetonicum和C. saccharobutylicum等菌株，其中对丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum的研究最广泛和深入。微生物生产丁醇的主要问题是产物浓度低、产率低、分离成本高，因此生物丁醇的生产需要对现有的发酵体系及菌株进行改造，才有可能满足工业化需求。传统的菌株改造是基于诱变的随机筛选，工作量大，而且经过过去长期诱变筛选，其提升丁醇生产能力的空间已经很小。2001年丙酮丁醇梭菌基因组的测序完成[1]，为研究者们对丁醇生产进行系统生物学的研究提供了可能。现在转录组学[2]、蛋白组学[3]、代谢网络模型[4-6]等方面都有广泛的研究报道。虽然现在对丙酮丁醇梭菌产丁醇的认识已经有了很大的进步，但是通过菌株改造来提升丁醇生产能力的工作却进展不大。主要原因是由于厌氧梭菌的遗传操作比较困难，转化效率低 (103～105转化子/μg DNA)[7]，传统的同源重组方法难以进行。虽然目前已经有梭菌遗传操作成功的报道，但是往往效率不高或使用范围受限，遗传操作工具的高效性仍是目前产丁醇菌株改造的一个制约因素。本文主要以丙酮丁醇梭菌模式菌株ATCC824为介绍对象，对其遗传操作系统的发展历史及原理进行了总结，分析了其局限性，并对未来的发展进行了展望。

1 丙酮丁醇梭菌的转化

由于丙酮丁醇梭菌不具备自然转化的能力，所以将外源 DNA导入到梭菌细胞内就需要采取物理或化学的方法。Truffaut等[8]利用制备原生质体的方法对丙酮丁醇梭菌 NI-4081菌株进行了转化，其方法是在含蔗糖的培养基中培养细菌，待生长到一定阶段后利用溶菌酶和青霉素G去除细胞壁，然后在聚乙二醇溶液中进行转化。但原生质体制备、转化和原生质体再生过程比较复杂、耗时，目前比较常用的仍是操作简单的电转化方法。电转化法是指细胞在瞬间的高压电场中，细胞膜可以形成空隙，从而使得外源DNA进入到细胞内。Mermelstein等使用的方法[7]是目前最为通用的方法，其主要内容为使用ETB溶液 (272 mmol/L蔗糖溶液 (pH 7.4)，5 mmol/L NaH2PO4) 作为电转溶液，电转参数为电压25 kV，电容25 μF，电阻∞，电击杯0.4 cm，转化效率最高可达105个转化子/μg DNA。由于丙酮丁醇梭菌是严格的厌氧菌，所以制备感受态细胞的过程是在厌氧条件下 (厌氧箱内) 完成的，目前还没有在有氧条件下成功转化丙酮丁醇梭菌的报道。

Tyurin等利用特制的电转仪对丙酮丁醇梭菌进行了方波高压脉冲 (电压 12 kV; 脉冲持续时间为22.5 ms，脉冲频率100 kHz) 电转化[9]，使得梭菌的转化效率超过106个转化子/μg DNA，是目前报道的最高转化效率，然而由于这种特制的电转仪还没有商业化，所以研究丙酮丁醇梭菌通常使用的还是Mermelstein等的方法[7]。

限制修饰系统 (Restriction-modification system)是自然界很多细菌中存在的一种细菌免疫系统，用于降解入侵的外源 DNA，保护自身 DNA。在丙酮丁醇梭菌的模式菌株 ATCC824中也存在着一种名为 Cac824I的二型限制修饰系统，识别-GCNGC-位点。大多数来自大肠杆菌的质粒由于这个位点上没有甲基化保护且具有多个拷贝，所以这样的质粒是不能够转化梭菌的。Mermelstein等利用表达有来自枯草芽胞杆菌噬菌体Ф3tI甲基化酶的大肠杆菌进行质粒的甲基化修饰，第一次实现了来自大肠杆菌的质粒的成功转化[7,10]。作者根据发表的丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组信息及REBASE网站的预测，选择CAC1502基因，利用二型内含子的方法对其进行了失活，得到的突变体菌株SMB009转化时质粒不再需要特异的甲基化修饰[11]。在丙酮丁醇梭菌中，限制修饰系统可能是不能利用接合方法进行基因转移 (Gene transfer) 的一个关键因素，SMB009菌株将可能实现梭菌的接合操作。

2 丙酮丁醇梭菌中的复制型质粒及表达质粒

1989年，Truffaut等最早证明了pIM13、pT127、pBC16可以通过电击转化导入Clostridium acetobutylicumN1-4081中[12]，并构建了E. coli-C.acetobutylicum穿梭型质粒，Azeddoug等也利用pIM13构建了新的穿梭载体，使用PEG介导的原生质体转化方法转化[13]。1990年 Williams等把来自pAMβ1 (Enterococcus faecalis)、pCB101 (C. butyricum)、pWV01 (Streptococcus cremoris) 的复制子与RK2型oriT片段相连接，构建成可接合的穿梭型质粒，首次成功地利用了 IncP型质粒的接合原理，将质粒导入C. acetobutylicumNCIB 8052 (现定名为C. beijerinckiiNCIMB 8052)中[14]。但是对于其他的丙酮丁醇梭菌如ATCC824、DSM1731、DSM792等均未见有利用接合方法导入质粒的报道，所以这种方法可能只适用于C. beijerinckii。上述复制型质粒都是来自非梭菌的菌株，1990年Yoshino等首次将分离自C. acetobutylicumstrain No. 86的质粒pCS86(3.0 kb) 改造成了可与E. coli穿梭的质粒，成功转化了不含质粒的C. acetobutylicumstrain No. 220[15]。1992年Lee等利用来自链球菌的质粒pMU1328，来自丁酸梭菌的pCBU2，来自C. perfringens的pJC4、pJU22，来自Streptococcus faecalis的pAMβ1，来自Bacillus subtilis的 pIM13质粒构建了 pSYL2、pSYL7、pSYL9、pSYL14四个穿梭质粒，由于ATCC824中限制修饰系统的限制，只有pSYL2可以成功转化，而这 4个质粒都可以以 8×102～6×103个转化子/μg DNA的效率转化NCIMB8052[16]。目前在ATCC824菌株使用的大多数质粒是衍生自pIM13或pAMβ1。

3 丙酮丁醇梭菌中的基因失活策略

基于 Mermelstein等报道的丙酮丁醇梭菌电转化方法[7]，Green等首次利用自杀质粒成功地在梭菌中实现了基因敲除[17]。然而由于梭菌的转化效率较低，利用自杀质粒进行同源重组的成功率极低，所以后来发展出了以复制型质粒为基础的反义 RNA抑制、复制型质粒同源重组及二型内含子基因敲除技术。2010年作者构建的限制修饰系统缺陷型菌株SMB009使得这些操作都可以使用非甲基化的DNA来进行。丙酮丁醇梭菌遗传操作系统发展历史上的重要事件总结见图1。

图1 丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统发展历史Fig.1 History of genetic modification systems ofClostridium acetobutylicum.

3.1 基于非复制型质粒的同源重组

Green和Bennett使用电转化方法将非复制型质粒导入到C. acetobutylicum中，通过同源重组单交换方法将丁酸激酶基因buk、磷酸转乙酰酶基因pta、醇/醛脱氢酶基因aad、调控因子编码基因solR成功敲除[17-19]。由于该方法成功率较低，在过去十多年的发展中，使用非复制型质粒通过同源交换的方法敲除基因的成功例子只有这几个。

3.2 基于复制型质粒的同源重组

由于自杀质粒同源重组的低效率，有研究者开发出了复制型质粒进行基因敲除的方法。这种方法理论上将会比较容易得到突变体，因为含同源片段的质粒可以在细胞内复制，可以在几代中存在，这样就增加了同源交换片段间接触的频率和时间。pLHKO即是应用于梭菌的这样一个质粒[20]，它含氯霉素抗性基因，有来自pIM13的复制子保证其在梭菌内的复制。在实际应用中，将目的基因两侧的同源片段连入载体，中间再引入一个红霉素抗性基因，将质粒转入菌体。得到的阳性转化子在无抗平板上培养，通过印模的方法连续转板几次，最后将其转印到只含红霉素的平板上筛选，得到的红霉素抗性克隆再进行验证。spo0A基因的敲除是成功使用这种方法的例子[20]。

Soucaille等在2006年对基于复制型质粒的同源重组的方法在梭菌中应用申请了专利[21]，并在质粒上引入了负筛选Marker尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(由upp基因编码，其存在可使菌体对5-氟尿嘧啶敏感) 用于双交换的筛选。Heap等在 2009年申请的专利中对复制型质粒同源重组方法引入了新的策略[22]：在同源片段后面连入一段不含启动子的抗性基因，当质粒呈游离状态时，该抗性基因不表达，当质粒通过同源重组整合到染色体上时，该抗性可以利用靶基因的启动子表达自身，从而表现出抗性(图2)。由于前面介绍的复制型质粒同源重组方法筛选整合子时，需要筛选大量的克隆，工作量很大，这个策略可以有效地解决这个问题。

3.3 反义RNA技术

Desai和Papoutsakis尝试使用了反义RNA技术对菌株进行代谢改造。他们针对buk和ptb的mRNA的靶点设计了 2个反义 RNA表达载体 pRD4和pRD1，结果使得含pRD4的菌株中丁酸激酶酶活下降85%，丁醇和丙酮的产量分别上升50%和30%。含pRD1的菌株中磷酸丁酰转移酶活性下降70%，同时丙酮和丁醇产量下降96%和75%。这与buk基因敲除菌株得到的结果和推论相符[23]。Tummala利用反义RNA技术下调了丙酮途径中的adc和ctfA/B的表达。结果发现虽然靶标酶的酶活都有下降，但是adc的下调不影响丙酮的形成。下调ctfA/B却可使丙酮和丁醇的产量明显下降。这说明丙酮途径中adc不是关键的，而ctfA/B是关键基因[24]。

3.4 二型内含子基因失活技术

2007年有研究者发展了一种适用于梭菌的内含子插入失活方法。内含子插入法失活基因的主要原理是来自乳酸菌的ltrB基因的II型内含子在特定宿主中由宿主启动子表达，并从mRNA前体自剪接下来，形成特定结构的 RNA，在多功酶蛋白 LtrA的辅助下，可以识别DNA上特定的序列，并且插入到特定的位点中，通过反转录合成互补链，最终以双链形式插入到特定的DNA序列中 (图3)。由于内含子插入DNA的识别位点主要由内含子的EBS1d和EBS2两个位置的短序列来识别，因此根据一定的机制和算法改造内含子，则内含子就会识别特定的位点[25]。英国 Nottingham大学 Minton教授领导的研究组和中国科学院上海植物生理研究所姜卫红研究组都基于这种原理开发出了适合梭菌中使用的内含子插入型基因失活质粒[26-27]。研究者们已经使用这种方法成功敲除了buk、spo0A等基因。作者对Minton开发出的Clostron系统进行了改进，构建出了pMTL008和pMTL099载体[11]。目前已报道的二型内含子载体特点见表 1。特定位点插入内含子的设计是基于一种特定的算法，这个方法目前已被Sigma-Aldrich公司商品化，并且只有购买其产品时才有限定次数的使用权。另外由于内含子的插入识别机理目前还没完全得到解析，现在所认识到的规律是结合一些统计学分析及结构预测而得到的，所以内含子会以一定的概率插入到非靶位点。染色体DNA的插入位点也要符合特定的结构要求才能使得内含子能够插入，因此对于任意DNA位点的操作有一定限制。这种方法目前主要用于基因的插入型失活，对于缺失型失活不太适合或是比较麻烦。

图2 Heap法基因敲除策略示意图Fig.2 Heap strategy for gene knockout.

表1 四种二型内含子载体特点比较Table 1 Characteristics of four vectors bearing group II intron

图3ltrB二型内含子基因敲除策略示意图Fig.3 The process of gene knockout usingltrBgroup II intron.

4 展望

目前，多种适用于丙酮丁醇梭菌的遗传操作方法已经被开发出来，使得研究者能够进行在梭菌细胞中进行遗传学基础研究和菌株改造工作。然而，这些遗传操作方法也同时存在着不同的局限性 (表2)。由于丙酮丁醇梭菌的转化效率不高，所以利用非复制型质粒进行同源重组的成功率非常低，而利用复制型质粒进行同源重组的方法虽然增加了载体上同源片段与染色体上的同源片段的交换机会，但是筛选时的工作量比较大。Heap的方法是解决这种筛选时大工作量的一个好方法，然而，它不适用于那些在筛选条件下弱表达或不表达的基因。反义RNA技术已被成功应用于梭菌中一些基因的下调表达，但是它的下调程度是不容易控制的，而且利用该方法很难实现完全失活某个基因。二型内含子法是目前梭菌中最为有效的基因敲除方法，但是它的特点是插入位点满足一定的碱基组成才能够被插入，所以对于一些不含这样的插入位点的基因是不适用的，另外内含子插入位点识别算法是基于大肠杆菌的识别序列统计出来的，对于梭菌可能还需要一定的调整，且1个内含子可能识别多个插入识别位点，所以有时不能确保准确插入到靶位点中。

表2 现有丙酮丁醇梭菌中遗传操作系统局限性分析Table 2 The disadvantages of current genetic modification systems ofC. acetobutylicum

基于以上的分析，我们认为丙酮丁醇梭菌的遗 传操作系统还有很大的提升空间，主要包括以下几个方面：第一，提高转化效率。对于基于非复制型质粒的同源重组方法，需要配合高效的转化方法才可能得以实现，所以提高转化效率是该方法的突破口。开发梭菌在空气中 (非厌氧条件) 进行转化的方法将会有利于简化操作，并且可以使得大规模的优化操作或特殊仪器的使用提供条件。第二，发展新策略。对于目前转化效率不高的情况下，复制型质粒的同源重组方法应该是最有潜力的方法，对于双交换而言，Heap法解决了第一步交换的筛选问题，Soucaille法解决第二步交换的筛选问题，那么两种方法的结合将会是一种理想的敲除策略。第三，引入成熟的方法。将在大肠杆菌或是芽胞杆菌等模式生物中发展起来的方法或策略 (如基于lambda噬菌体Red重组酶的重组工程) 应用到丙酮丁醇梭菌中，将会实现梭菌的高效遗传操作。

致谢：感谢中国科学院微生物研究所的朱岩帮助绘制图3。

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Genetic modification systems forClostridiumacetobutylicum

Hongjun Dong, Yanping Zhang, and Yin Li

Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:June 15, 2010;Accepted:August 15, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA02Z237).

Corresponding author:Yin Li. Tel/Fax: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2006AA02Z237) 资助。