联合检测外周血AFPmRNA、h-TERT mRNA对肝细胞肝癌的诊断价值*

张利国,周 杰,林建华,张 兴

(1.南方医科大学附属南方医院肝胆外科,广州510515;2.河南省鲁山县人民医院 467300)

肝细胞肝癌是一种严重危害人类生命健康的恶性肿瘤。其发病率居高不下,早期发现、早期诊断、早期治疗可以提高患者的生存率,改善其预后[1]。而对肝肿瘤的早期诊断,目前采用的B超、CT扫描等手段通常难以实现;检测AFP可以作为肿瘤标志物用于肝癌人群筛检,但其阳性率和特异性较低,结果不够理想,因而使用新的、更为敏感的肝癌标志物就显得非常的必要。作者应用灵敏的荧光定量PCR技术分析肝细胞肝癌患者外周血中AFP mRNA、h-TERT m RNA的表达量作为肿瘤标志物,达到对肝细胞肝癌的早期诊断,为临床早期诊断提供更为合理的方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 南方医科大学附属南方医院肝胆外科2008年1～11月收治的肝癌患者,术前经影像学、血清AFP检测以及临床资料证实为原发性肝癌,并行肝癌切除手术治疗,术后经病理证实为肝细胞癌患者60例,其中男38例,女22例,患者平均年龄(51.2±10.4)岁;血清 AFP阳性(AFP≥200μg/L)40例(66.7%);肿瘤直径大于或等于 5 cm者 36例(60%);肉眼及镜下门静脉癌栓14例(23.3%);肝内转移者16例(26.7%);肝外转移者8例(13.3%);肿瘤细胞分化程度高、中、低度者分别为 20例(33.3%)、28例(46.7%)、12例(20%)。对照组为35例肝外良性病变者或健康人。

1.2 标本采集 所有对象均于清晨空腹采集外周静脉血5 mL,应用含EDTA的抗凝剂抗凝。静脉血采集后立即提取总RNA。

1.3 总RNA的提取与cDNA的合成 总RNA的提取按TRIZOL(invitrogen)说明书进行操作。总RNA提取后即进行cDNA合成,反应体系包括:(1)5×缓冲液4μL;(2)dNTP(10 mM)1μL;(3)随机引物(50 uM)1μL;(4)RNasin(40 u/μL)1μL;(5)M-MLV(200 u/μL)1μL;(6)总 RNA 1～2μg;(7)加DEPC处理的三蒸水至20μL。在全自动PCR仪按照说明设定参数,产物置于-20℃冰箱备用。

1.4 荧光定量 PCR检测AFP mRNA、h-TERT mRNA方法的建立

表1 AFP mRNA和h-TERT mRNA在肝癌和对照组的相对表达量

1.4.1 引物的设计、合成 从GenBank中调出 AFP和h-TERT的 RNA序列,根据引物设计原则,利用Primer Premier 5.0软件设计引物,跨内含子序列。AFP上游引物:5′-AGA TAG CAA GAA GGC ATC CCT T-3′;下游引物:5′-CCT TTG TTT GGA AGC ATT CAA CTG 3′;h-TERT上游引物:5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′;下游引物:5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′;GAPDH上游引物:5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA TG-3′;下游引物:5′-CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC T-3′;引物由上海英骏公司合成。

1.4.2 FQ-PCR定量分析 用real-time PCR仪(Bio-Rad公司)及SYBRGreenⅠ(北京百泰克公司)试剂,进行荧光定量分析AFP mRNA 、h-TERT mRNA含量,并用GAPDH作为参照正常化校正。分别用AFP、h-TERT的cDNA样品和GADPH样品倍比稀释做标准曲线,呈现良好的线性关系,r2分别是0.999、0.998和0.999。样品管均外加 2个复管,结果取其均值,另设空白和阴性对照管。FQ-PCR反应条件:93℃预变性2 min,93℃45 s,55℃120 s,共 45个循环,反应结束后荧光定量仪自动给出相关的结果和曲线。

1.5 统计学方法 以ΔCt为差异比较的基础,相对定量公式为 2-ΔΔCt;其中 ΔΔCt=ΔCt(未知样品)-ΔCt(内参),结果为倍数关系。Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时(处于指数上升期)所需反应循环数大小。Ct值越大,参与反应的起始的模板量就越小,反之则越大。用SPSS13.0软件对数据进行统计分析,组间的比较和相关性统计均用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

以循环数Ct为纵坐标,以样品各稀释度的倍数值为横坐标作标准曲线,观察到各个指标的扩增效率基本一致,可以用2-△△CT分析数据,结果见表 1。

各组间表达结果差异显著,同时AFP mRNA、h-TERT mRNA在各组中的阳性表达也存在较大差异,结果见表2。

表2 AFPmRNA、h-TERT mRNA在两组表达情况[n(%)]

在对照组35例中,无论是AFP mRNA还是h-TERT mRNA,几乎没有表达,仅1例h-TERT mRNA表达阳性,而在肝细胞肝癌中二者都有明显的表达,两组之间差异具有统计学意义(P＜0.01)。在肝细胞肝癌患者中,AFPmRNA和h-TERT mRNA的阳性检出率分别为76.7%、83.3%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。进一步分析它们表达的相关因素,有远处转移与肝内转移者阳性率均为100%。其表达和血清中AFP的量以及肿瘤的分化程度没有明显相关性(P＞0.05),与门静脉癌栓也密切相关(P＜0.05)。

3 讨 论

由于mRNA不仅是基因在转录水平的表现,也可作为细胞表型的标志,能在细胞无任何形态变化的情况下判断该细胞的表现型,因此,其作为肝细胞肝癌诊断指标可以发现一些早期甚至是亚临床期的肝细胞肝癌。现采用外周血循环细胞RNA进行反转录PCR检测肿瘤标志物的表达情况,由此判断是否存在癌细胞,以达到早期诊断肿瘤的目的。在部分肝细胞肝癌患者中,由于AFP基因在表达过程中翻译缺失而停止转录之后,血清AFP表达为阴性[2],而AFP mRNA则为阳性,故检测AFP mRNA可对血清AFP阴性的患者做出早期诊断,弥补了现行单纯以AFP作为诊断依据的不足。本研究也证实,肝细胞肝癌患者 AFP阳性率为 66.7%,而AFP m RNA的阳性率为76.7%,是比AFP更加敏感的指标。近年来,国内外很多学者报道了RT-PCR法检测外周血中AFP mRNA在肝癌诊断和鉴别诊断中的作用。石宏等[3]报道检测患者外周血中癌细胞表达的AFP m RNA阳性率为76%,高于血清AFP阳性率64%,表明检测AFP m RNA较 AFP灵敏度高,在部分血清AFP阴性的肝细胞肝癌患者,检测外周血AFPm RNA有助于诊断的确立。Zhu等[4]的研究结果表明,外周血AFP m RNA在原发性肝癌患者中的检出率为53.7%,AFP mRNA检出率与血清AFP浓度之间无明显关系。因此,检测外周血AFP mRNA与血清AFP有互补性,对血清AFP阴性的部分PHC可做出诊断,提高诊断准确率。本研究以单纯的肝细胞肝癌为对象,排除了胆管细胞癌和混合细胞癌,故AFP mRNA的结果更高,达到 76.7%,阳性率也显著提高。Tamaoki和Fausto[5]认为在肝细胞肝癌患者中,AFP基因的表达再次被激活,其AFP m RNA的水平高于正常肝细胞的30～1 000倍。本实验证明,如果应用更为灵敏的荧光定量PCR技术,则肝细胞肝癌患者外周血中AFP m RNA的检出率明显增高,但总体阳性率仍不是非常满意,存在偏低的问题。本研究的阳性率也只有76.7%,如果采取联合检测h-TERT m RNA则可以较好地解决这个问题。徐焰等[6]证实,联合检测可以明显提高肝癌的诊断率。h-TERT mRNA在良性疾病患者和健康人中几乎不表达,在恶性肿瘤患者中才会出现较高的表达,是检测恶性肿瘤的一个很好的标志物。大多数恶性肿瘤端粒酶活性升高,检测端粒酶的表达为恶性肿瘤的诊断和治疗开辟了新的途径,已成为诊断恶性肿瘤和判断预后的重要指标。Wang等[7-8]应用荧光定量技术检测外周血中h-TERT mRNA的表达,结果显示该项指标在作为肿瘤标志物的价值优于AFP m RNA。本实验的结果也说明,h-TERT m RNA是比AFP mRNA更敏感的指标,其阳性率达83.3%。总体来说,单纯应用一种作为检验指标还存在阳性率较低的问题,如果把两者结合,则可以使肝细胞肝癌的检出率提高到92.6%,比现行的检测AFP的做法优越,同时其特异性也达到97.2%,是非常理想的肿瘤诊断标志物。

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[3] 石宏,马振华,郝大林.联合检测外周血中AFPmRNA和AFP在原发性肝癌诊断中的临床意义[J].中国实验诊断学,2008,12(5):637.

[4] Zhu YS,Yang DM,Yao DF,et al.The clinical value of united detecting AFP mRNA and alumin mRNA in peripheral blood[J].Chinese Journal of Digestion,2002,22(3):176.

[5] Tamaoki T,Fausto N.Expression of theα-fetoprotein gene during develoment,regeneration and carcinogenesis[M].In:Stein,Stein,eds.Recombinant DNA and cell proliferation.San Diego:Academic Press,1984:145.

[6] 徐焰,陈名声,郝晓柯.联合检测血清AFU、AFP肿瘤标志物在原发性肝癌诊断中的临床价值[J].重庆医学,2008,12(24):2805.

[7] Wang WB,Rui JG,Liu YH,et al.The detection ofα-fetoprotein mRNA in peripheral blood of patients with hepatic carcinoma and its clinical significance[J].Chinese Journal of Experimental Surgery,2000,15(1):47.

[8] Shay JW,Bacchett IS.A survey of telomerase activity in human cancer[J].EurJ Cancer,1997,33(5):787.