西维来斯他对油酸-内毒素介导大鼠ALI/ARDS的肺保护作用

蔡振刚,董晨明

(兰州大学:1.第二临床医学院 730000;2.第二医院重症医学科 730010)

Ashbaugh首次报道急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)后世界各国对ARDS的研究逐步深入,但其病死率仍高达35%～50%[1-4]。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和ARDS是严重创伤或感染后出现最早、发病率最高的并发症,也是直接导致患者死亡的主要原因[5]。ARDS是各种炎症因子间的相互作用,引起中性粒细胞的活化和血管内皮细胞黏附分子表达,中性粒细胞聚集脏器并释放弹性蛋白酶是引起肺损伤的主要原因之一。西维来斯他是一种弹性蛋白酶抑制剂,能够选择性地抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。本研究中采用油酸-内毒素贯序静脉注射制备大鼠ALI/ARDS模型,观察西维来斯他持续静脉泵注对ALI/ARDS大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶、髓系细胞触发受体-1的影响,阐明西维来斯他在ALI/ARDS的肺保护作用,以期为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 SPF级SD大鼠48只,雌雄各半,体质量190～215 g,购自甘肃省中医学院实验动物中心。制备大鼠ALI/ARDS模型,将大鼠称重、编号,禁食 6 h,禁饮水4 h。以巴比妥钠注射液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后固定,常规消毒,铺无菌洞巾。在大鼠左股部内侧作一长约1 cm的切口,暴露股静脉并分离,避免损伤股动脉及股神经。用5号针头穿刺入股静脉固定以备输液。空白对照组仅给予等量生理盐水注入。其余3组均以油酸0.2 m L/kg尾静脉推注,2 h后用内毒素以2 mg/kg尾静脉推注。

1.2 动物分组及给药 将48只大鼠按随机数字表法分为空白对照组(n=12)、模型对照组(n=12)、预处理组(n=12)和后处理组(n=12)。空白对照组、模型对照组仅给予等量生理盐水以微量泵泵注。预处理组在制备动物模型的同时给予西维来斯他5 mg◦kg-1◦h-1泵注,后处理组在制备动物模型后2 h给予西维来斯他5 mg◦kg-1◦h-1泵注。

1.3 标本采集与处理 在各组动物制备模型6 h后股动脉采血留取4 mL于普通试管中,25℃、2 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min,分离血清,-20℃保存待检。用静脉留置针插入气管反复用生理盐水行右肺支气管肺泡灌洗,每次灌洗2 mL,反复3次,收集灌洗液,记录回收量,并保证回收率在70%以上。灌注液以2 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min,取上清液测定。严格无菌留取左肺组织,10%甲醛固定,病理切片后用HE染色。

表1 西维来斯他对ALI/ARDS大鼠血清中性粒细胞弹性蛋白酶和BALF-NE水平的影响(±s,n=12)

表1 西维来斯他对ALI/ARDS大鼠血清中性粒细胞弹性蛋白酶和BALF-NE水平的影响(±s,n=12)

与空白对照组比较,*:P＜0.01;与模型对照组比较,Δ:P＜0.01;与后处理组比较,#:P＜0.05。

检测指标 空白对照组 模型对照组 预处理组 后处理组血浆NE(ng/L) 32.476±3.280 43.212±1.682 36.796±2.393*Δ# 38.899±2.230*Δ BALF-NE(ng/L) 35.388±3.280 50.703±2.183 40.955±3.894*Δ# 45.639±4.459*Δ

表2 西维来斯他对ALI/ARDS大鼠肺干/湿重比、BALF TREM-1中性粒细胞计数水平和BALF的影响(±s,n=12)

表2 西维来斯他对ALI/ARDS大鼠肺干/湿重比、BALF TREM-1中性粒细胞计数水平和BALF的影响(±s,n=12)

与空白对照组比较,*:P＜0.01;与模型对照组比较,Δ:P＜0.01;与后处理组比较,#:P＜0.05。

检测指标 空白对照组 模型对照组 预处理组 后处理组肺干/湿重比 4.087±0.379 5.333±0.410 5.010±0.368*Δ# 4.712±0.304*Δ TREM-1(ng/L) 35.065±2.797 43.704±3.996 37.611±2.233*Δ# 39.889±2.633*Δ中性粒细胞计数(×105/L) 3.045±0.298 42.983±3.342 24.248±2.264*Δ# 17.769±1.803*Δ

1.4 检测指标及方法 (1)支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞计数:将0.1 mL的BALF加入血细胞计数板计数细胞总数。(2)中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和髓系细胞触发受体-1(triggering receptor expressedon myeloid cells-1,TREM-1)测定:在各时间点断尾采血,以2 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min,取上清液测定。(3)支气管肺泡灌洗液的中性粒细胞弹性蛋白酶的水平测定:用无菌生理盐水2 mL灌注右肺,反复冲洗,回吸量大于注入量的70%,灌注液以2 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min,取上清液测定。(4)肺组织的干湿比重测定:每组每只大鼠称取约0.25 g左侧湿肺组织,用滤纸吸净表面血迹后准确称取其质量,用电热恒温干燥箱80℃下烘干,48 h后称干重,按公式计算肺干/湿重比。

1.5 病理学观察 取相同部位左侧肺组织10%甲醛固定1周,梯度乙醇脱水,切取相同部位肺组织制成标本,常规切片,石蜡包埋,苏木素-伊红染色,光学显微镜下观察肺组织肺形态学病理改变。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件,所有计量数据均以±s表示,各实验组间的两两比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ALI大鼠的BALF中性粒细胞弹性蛋白酶的水平和中性粒细胞计数的变化及西维来斯他治疗的影响 与模型对照组比较,预处理组和后处理组的BALF中性粒细胞弹性蛋白酶水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)。与后处理组比较,预处理组BALF中性粒细胞弹性蛋白酶水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),见表 1。

2.2 ALI大鼠血浆中性粒细胞弹性蛋白酶和TREM-1的变化及西维来斯他治疗的影响 与模型对照组比较,预处理组和后处理组的血清中性粒细胞弹性蛋白酶水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01),血清 TREM-1的水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)。与后处理组比较,预处理组血清中性粒细胞弹性蛋白酶水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),血清TREM-1的水平明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),见表 2。

图1 正常对照组肺组织6 h病理变化(HE染色,×200)

图2 模型对照组肺组织6 h病理变化(HE染色,×200)

图3 预处理组肺组织6 h病理变化(HE染色,×200)

2.3 ALI大鼠肺组织病理变化及西维来斯他治疗的影响见图1～4。

图4 后处理组肺组织6 h病理变化(HE染色,×200)

3 讨 论

ALI是指严重感染、创伤等打击后,出现以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致肺水肿和微肺不张为病理特征,临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症,严重者即为ARDS[6]。目前ALI和ARDS患者的病死率仍然很高。本研究采用油酸和内毒素贯序注射旨在模拟临床严重创伤合并感染时肺损伤的演进过程。油酸静脉注射后形成ARDS的机制是首先引起肺毛细血管脂肪栓塞,造成血管内皮损伤,进而引起肺泡毛细血管膜的通透性增加,肺间质和肺泡损伤[7]。静脉注射内毒素相当于严重革兰阴性菌释放内毒素入血。已经证实A LI的机制:(1)由于内毒素的直接损伤;(2)机体释放大量的炎性细胞及递质(如TNF-α、IL-1β、IL-8等)使机体的抗炎与促炎平衡破坏,引发肺脏的过度炎症反应,造成肺组织的急性损伤。

本研究结果显示,模型对照组动物血清和BALF中NE含量增高,说明油酸可导致肺泡毛细血管的脂肪栓塞,加重血管内皮细胞的破坏,使各种炎性细胞渗出,内毒素刺激机体后,激活免疫细胞和炎性细胞释放大量炎症介质和细胞因子,中性粒细胞激活释放大量的NE,使血清NE升高。模型对照组、预处理组和后处理组比较,预处理组和后处理组血清NE增加的幅度明显低于模型对照组(P＜0.01),提示西维来斯他能有效地抑制NE的生成及活性,减轻肺组织损伤。预处理组和后处理组比较,预处理组血清NE增加的幅度明显低于后处理组(P＜0.05)。后处理组和预处理组比较,后处理组BALF中性粒细胞增加的幅度明显低于预处理组(P＜0.05)。中性粒细胞弹性蛋白酶活性增加所导致的蛋白减少会破坏细胞表面和基膜的完整性,致使肺泡的通透性增加[8]。另外,这些中性粒细胞弹性蛋白酶的基质降解的作用与中性粒细胞移位[9]和趋化性肽的产物包括白介素-8有关。NE可分解血管基膜和间质,增强肺组织ICAM-1的表达,使中性粒细胞与内皮细胞之间的黏附更加牢固而进一步激活中性粒细胞,形成一种恶性循环,加重肺损伤。西维来斯他是小分子NE抑制剂,能可逆性且竞争性抑制NE。西维来斯他的保护作用在很大程度上是归功于其特别的抑制作用。它可以进入微环境并对氧化物酶具有特殊的抵抗作用。西维来斯他也能减弱BALF中炎症细胞浸润。这种中性粒细胞漏出至肺泡的减弱已经在病理切片中得到证实,NE抑制剂的有益作用对中性粒细胞浸润的改善不仅在ALI,也在缺血再灌注的炎症模型中得到证实。这种结果提示中性粒细胞漏出的媒介,也是减少中性粒细胞介导的毒性媒介。本研究表明不同时机应用西维来斯他可能会对 ALI/ARDS有不同的影响。研究表明早期应用NE抑制剂可能有效。NE是在本质上决定着ALI/ARDS危急进展的预测因素或者征兆。预测因素可能是 NE临界水平,它决定着某些ALI/ARDS患者进展。延迟性的应用NE抑制剂西维来司他在ALI出现后的肺泡水肿和中性粒细胞漏出有一定的防止作用。

TREM-1是一种新型的炎症激发受体,其主要表达在中性粒细胞及单核细胞膜表面。它的天然配体目前还不明确,其表达主要受细菌、真菌及细菌代谢产物脂多糖(LPS)上调。通过激活中性粒细胞及单核细胞引起白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症前化学增活素的分泌,从而在炎症反应中发挥重要的作用[10]。TREM-1广泛表达于皮肤、淋巴结、肺组织中,在血嗜中性白细胞、CD14+单核/巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、肉芽肿及周围的单核细胞源性的上皮样细胞上高表达,在非感染性炎症如分支杆菌属结核菌或异质体肉芽肿引起的肉芽肿感染中很少或不表达[11]。TREM-1的细胞和组织分布特点提示其在抗感染炎症反应中起作用。TREM-1有促进炎性因子分泌的作用[12],能诱导中性粒细胞和单核细胞分泌 TNF-α、IL-1β、IFN-γ等促炎因子,中性粒细胞趋化因子 IL-8,单核细胞趋化因子MCP-1和MCP-3,活化单核细胞表面的CD40、CD86和CD54等共刺激分子,还能诱导中性粒细胞释放髓过氧化物酶。TREM-1在脓毒血症等急性炎症反应中具有重要的作用,在人的炎症组织及腹腔液中局部浸润的中性粒细胞、巨噬细胞表面的TREM-1均处于高水平表达。它介导的信号传导通路在炎症反应的发生和级联放大中起重要作用。本研究结果显示,模型对照组、预处理组和后处理组比较,预处理组和后处理血清TREM-1增加的幅度明显低于模型对照组(P＜0.01)。预处理组和后处理组两组比较,预处理组血清TREM-1增加的幅度明显低于后处理组(P＜0.05)。西维来斯他降低ALI时BALF中的TREM-1的水平,其直接机制尚未清楚。其机制可能为TREM-1激活后,可上调其下游的 TNF-α、IL-1β、GM-CSF等细胞因子的表达,并抑制抗炎症反应因子白介素-10(IL-10)的表达;同时,它激活的这些下游的细胞因子又能正反馈地上调其表达。这样,TREM-1与这些下游细胞因子之间形成一个正反馈的自分泌调节回路,促使炎症反应增强、放大[13-14]。TREM-1与ALI之间的关系尚需进一步的研究。

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