利用唾液斑DNA上12S rRNA基因片段进行动物种属鉴定

黄娅琳

（1.南京森林警察学院，江苏南京210046；2.国家林业局野生动植物物证鉴定中心，江苏南京210046）

利用唾液斑DNA上12S rRNA基因片段进行动物种属鉴定

黄娅琳1，2

（1.南京森林警察学院，江苏南京210046；2.国家林业局野生动植物物证鉴定中心，江苏南京210046）

目的通过检测唾液斑DNA确定案件所涉及动物的种属。方法通过提取动物唾液斑DNA，扩增其线粒体DNA上的12S rRNA基因片段，并进行DNA测序，测序结果在GenBank上进行BLAST搜索，再利用DNAMAN软件进行同源性分析。结果从唾液斑中成功地提取到了基因组总DNA，并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA基因片段。结论所报道的方法能用于动物种属鉴定。

唾液斑DNA；12S rRNA；种属鉴定

Abstract：Objective To identify the genus of animals that are related to cases by analyzing DNA from salivary stain.Methods After isolating DNA from salivary stain of animals，partial mitochondrion DNA of 12S rRNA gene were amplified and sequenced. Then the obtained sequence was searched with BLAST in the GenBank database，and the homology analysis was carried out using DNAMAN software.Results The genome DNA was successfully extracted from salivary stain and partial mitochondrion DNA of 12S rRNA gene were amplified.Conclusion The introduced method is applicable for classification of aminals.

Key words：salivary stain DNA；12S rRNA；animal classification

近年来，受经济利益驱使，非法收购、运输、出售野生动物及家畜的案件日趋增多。在许多案件中，由于送检样本非常微量，利用普通的形态学鉴定方法很难识别动物种属。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记及序列测定技术已越来越多地用于动物种属鉴定和亲子鉴定（如：牛、马、羊等家畜被盗案件），在案件的侦破过程中发挥着重要作用。在某些案件中，由于被鉴定的动物是活体，为避免在采集样本时对动物造成损害以及降低采样难度，通常提取动物唾液，并制成唾液斑送检。本研究拟通过提取动物唾液斑DNA，扩增其线粒体DNA上的12S rRNA基因片段，并对其进行DNA序列分析，以确定动物种属。

1 材料与方法

1.1 材料

广西省森林公安局送检的带动物唾液斑的纱布

1.2 方法

1.2.1 唾液斑DNA的提取

剪取纱布上唾液斑（约1 cm×1 cm大小），置于1.5 mL离心管中，用硅珠法[1]提取样品DNA。用分光光度法检测样本DNA的纯度和浓度。将样品总DNA置于-20℃保存，待用。

1.2.2 PCR扩增

扩增线粒体DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物：L1091和H1478[2]。实验设3个平行管及阴性对照。扩增反应在Biometra PCR仪（德国BIOMETRA公司，Tgradient）上进行。总反应体积为25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各2 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10-20 ng/μL模板1-2 μL（空白对照不加模板DNA），其他为灭菌蒸馏水。PCR反应所需试剂及引物均购自Takara公司。上述反应体系在94℃预变性3min，然后进入如下程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用DL2000（大连Takala生物技术公司）作为分子量标记，用凝胶成像系统（基因有限公司，GENEGENUS）检测、成像。

1.2.3 PCR扩增片段测序

PCR产物用PCR产物（小量）纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）纯化。以纯化产物为模板DNA，用ABI公司测序试剂盒进行测序PCR扩增（操作按试剂盒说明），扩增产物经甲酰胺变性后，上ABI公司3130xl测序仪进行测序。

1.2.4 BLAST搜索及序列对比

将测序结果在GenBank中进行BLAST搜索，并从数据库中下载相关物种的序列，用DNAMAN生物学软件进行同源性分析，确定动物种属。

2 结果

分光光度法测得唾液斑样本基因组总DNA的OD260/OD280为1.72，表明DNA纯度较高。样本总DNA浓度为18 ng/μL。

图1示唾液斑样本基因组总DNA电泳结果，由图可见，当上样量为10μL时，检测到基因组总DNA（箭头所示），表明样品中提取到的总DNA质量较高。此外，样品总DNA在分子量较小位置存在涂抹弥散（smear）现象，这可能是由于DNA部分降解或存在已降解的RNA的原因。空白对照管中没有检测到DNA。

图1 样本基因组总DNA琼脂糖电泳图

以唾液斑样本基因组总DNA为模板，扩增线粒体DNA上12S rRNA基因片段（图2），得到了清晰的PCR产物（箭头所示）。空白对照无扩增产物。

将PCR产物纯化后经3130xl测序仪进行测序，（结果如图3所示），得到416 bp的序列。经BLAST搜索、DNAMAN同源性分析，发现所检测的样本DNA保守片段序列与黄牛（Bos Taurus）线粒体DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性高达100%，据此推断唾液斑样本种属为黄牛。

图2 样本mtDNA 12S rRNA基因PCR扩增产物

图3 样品的mtDNA 12S rRNA基因序列

3 讨论

血液是传统上获取DNA的来源，但对于动物，尤其是猛兽，进行活体血样采集难度较大，常常需要麻醉动物。与之相比，唾液的采集较为容易，不会对动物造成伤害。人类口腔粘膜的上皮为复层鳞状上皮，具有代谢旺盛、更新快、易脱落的特点。它由多层细胞组成，基底层具有旺盛分裂能力，最表层的角化层已衰老退化，不断脱落。角化层细胞可以自然脱落到唾液中。这些细胞虽然细胞核固缩，但同样具有完整的基因组DNA序列，含有与白细胞、肝细胞等一致的高度多态性STR位点[3]，从而成为动物DNA种属鉴定以及法医学人类DNA多态性检测分型的生物性检材。各类口腔上皮脱落细胞检材所含的细胞量较少，DNA的含量常为微克级或纳克级，甚至为皮克级水平，为微量生物性检材[4]。因此，如何成功地获得足够量的DNA用于PCR扩增尤为重要。

本研究利用硅珠法成功提取了唾液斑中的DNA。硅珠法的基本过程是：裂解细胞、硅珠吸附DNA、洗涤硅珠-DNA复合物、溶解DNA、离心去除硅珠。其基本原理是：在高浓度的硫氰酸胍存在时，DNA能够被二氧化硅特异性吸附；当硫氰酸胍被洗涤干净后，DNA又可从二氧化硅上解离下来。硫氰酸胍是高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分离，在硅珠吸附前高速离心，可以将不溶的物质去除；吸附后的漂洗过程，则将溶解的PCR抑制剂洗去。因此，提取DNA的灵敏度比较高、速度快且不会受检材条件的影响。此外，本研究用针对mtDNA上12S rRNA基因片段的通用引物进行PCR扩增，获得了高纯度的目的基因片段，并利用Gen-Bank上丰富的序列资源，通过BLAST搜索、同源性比对确定唾液斑样本种属来源为黄牛。12S rRNA基因进化速度适中，一个较小的基因片段就包含了从种内到种间的进化遗传信息[5]，同时，GenBank中已经积累了大量的关于12S rRNA基因的序列资源，可为物种鉴定提供丰富的比照资源，也将为各类案件中的野生动物及其制品的鉴定带来极大的便利。

[1]王林生，苏勇，顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志，2000，15（1）：36-37.

[2]Kocher T，W Thomas，A Meyer，et al.Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals：amplification and sequencing with conserved primers[J].Proc Natl Acad Sci，1989，86（16）：6196–6200.

[3]张越，梅善宗.微量口腔粘膜脱落细胞检材STR位点的法医学检测分型[J].皖南医学院学报，2005，24（1）：74-76.

[4]徐庆，高金林，裴军昌，等.口腔脱落细胞DNA检验在刑事案件中的应用[J].泰州职业技术学院学报，2007，7（1）：70-71.

[5]Irwin D M，Kocher T D，Wilson A C.Evolution of the cytochrome b gene of mammals[J].J Mol Evol，1991，32（2）：128-144.

（本文编辑：李莉）

Animal Classification Using 12S rRNA Gene from Salivary Stain DNA

HUANG Ya-lin1，2
（1.Nanjing Forest Police College，Nanjing 210046，China；2.Wildlife Material Evidence Appraisal Center of National Forestry Administration，Nanjing 210046，China）

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2010.05.008

1671-2072-（2010）05-0043-02

2010-03-30

南京森林警察学院教研基金资助项目（ZD09202）

黄娅琳（1976-），女，博士，主要从事野生动植物物证鉴定。E-mail：huangyalin228@yahoo.com.cn。