菠萝渣淀粉功能降解菌筛选及s2b7-4的鉴定

贺军军,罗 萍＊,陈永辉,易润华,李勤奋

(1.中国热带农业科学院湛江实验站,广东湛江 524013;2.广东海洋大学,广东湛江 524088; 3.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 571737)

菠萝渣淀粉功能降解菌筛选及s2b7-4的鉴定

贺军军1,罗 萍1＊,陈永辉1,易润华2,李勤奋3

(1.中国热带农业科学院湛江实验站,广东湛江 524013;2.广东海洋大学,广东湛江 524088; 3.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 571737)

为了加快菠萝渣发酵,本试验通过利用多种选择性培养基,从自然发酵的菠萝渣中分离到多种淀粉分解菌,经过初筛和复筛,获得了降解菠萝渣的淀粉降解功能菌株s2b7-1和s2b7-4,筛选出其最适培养基为改良LB培养基及其优化组合。通过形态、生理生化和分子综合鉴定得出s2b7-4菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

菠萝渣;淀粉功能降解菌;s2b7-4

菠萝原名凤梨,原产巴西,目前已广泛分布在南北回归线之间,成为世界重要的果树之一。16世纪时传入我国,在广东、广西、福建、台湾等地区大面积栽培种植,种植面积达70000 hm2左右[1]。然而,由于菠萝保存期较短,收获后常用来加工罐头、浓缩汁和蜜饯等,而占全果重50%～60%的菠萝皮副产品多被堆积废弃,造成环境污染和资源浪费[2-3]。近年来,随着国内对废弃物综合利用的开发,菠萝加工副产品在肥料化方面的利用越来越受到重视,但多是通过自然堆放发酵制备有机肥,存在所用时间长、发酵臭气难处等问题。本研究从微生物加快菠萝渣发酵熟化的角度出发,通过对不同堆放时间的菠萝渣中的微生物进行分离、纯化和筛选,选出其中的高效降解淀粉菌株,并对其最佳功能培养基进行了筛选及优化,以期为菠萝渣肥料化的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 菠萝渣采自广东省丰收糖业发展有限公司堆积场。

1.1.2 培养基 淀粉培养基(S1):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO42.5 g,淀粉10 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0;淀粉蛋白胨酵母培养基(S2):MgSO40.5 g,KH2PO40.1 g,淀粉12 g,蛋白胨8 g,酵母粉2 g,蒸馏水1000 mL,pH 6.0;牛肉膏蛋白胨淀粉培养基(S3):NaCl5 g,淀粉2 g,蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良营养肉汤:牛肉膏10 g,蛋白胨5 g,淀粉10 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良IFFI24M:NaCl 5 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉10 g,酵母膏5 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 6.8;改良NA:NaCl 5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,淀粉15 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 6.6～7.0;改良LB:NaCl 5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0;改良YPG:NaCl 5 g,玉米粉7 g,蛋白胨20 g,淀粉15 g,酵母膏10 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0;改良BPY:马铃薯200 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0;改良PDA:马铃薯200 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL pH自然;改良BPDB:马铃薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0;BPsB:马铃薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉20 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL, pH自然;淀粉培养基:KH2PO40.3 g,MgCO31 g, NaNO31 g,淀粉10 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH自然;蛋白胨淀粉培养基:蛋白胨0.1 g,淀粉5 g,葡萄糖1 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL, pH自然;酵母膏淀粉培养基:淀粉5 g,酵母膏10 g,琼脂15 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.2。分离降解细菌用S1、S2和S3等培养基;菌株筛选用改良营养肉汤、改良IFFI24M、改良NA、改良LB、改良YPG、改良BPY、改良PDA、改良BPDB、BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培养基。

1.2 方法

1.2.1 分离与筛选 称取菠萝渣样品1.00 g,加入无菌水10 mL,在振荡机上振荡10 min,形成悬液,吸取1 mL悬液依10倍法稀释到10-6,取10-6稀释悬液0.1 mL分别涂布到S1、S2和S3培养基上;28℃黑暗培养4 d,计算菌落数。根据菌落形态、颜色等挑取单菌落,按常规方法纯化后保存。菌株筛选采取透明圈法。将分离得到的菌株接种到淀粉培养基平板上,28℃培养24 h后,取出平板,滴加碘液,测量透明圈和菌落的直径大小,挑选透明圈和菌落的直径比值较大的菌株保存备用;将初筛获得的菌株在淀粉培养基平板进一步筛选得到淀粉降解功能菌株。

1.2.2 功能培养基筛选 用改良营养肉汤、IFFI24M、NA、LB、YPG、BPY、PDA、BPDB和BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培养基,进行功能培养基筛选,每处理设3次重复。

1.2.3 功能培养基优化 对功能培养基成分按照正交试验L9(3)3进行优化,每处理设3个重复。

1.2.4 s2b7-4菌株鉴定 ①常规鉴定:对菌株的菌落形态,菌体形状、革兰染色、芽胞染色、耐盐性、硝酸还原、柠檬酸盐利用、H2S产生、纤维素分解、明胶液化、淀粉水解、吲哚产生、过氧化氢酶产生、V-P反应以及不同碳源的利用等生长培养特性及生理生化进行了测定。具体参照《常见细菌系统鉴定手册》[4]和《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版[5]等文献;②16S r DNA序列分析:改良的SDS法提取降解菌株s2b7-4和s2b7-1的基因组DNA为模板,以16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,16(-)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3为上下游引物扩增菌株的16S rDNA。其PCR体系为(25μL):模板2μL,上游引物1 μL,下游引物1μL,10×buffer 2.5μL,Mg(25 mmol/L)2.5μL,DNTP(2 mmol/L)2.5μL,Taq (3 U/μL)0.35μL,ddH2O 13.15μL。PCR扩增条件:94℃预变性4 min,94℃变性1 min,50℃退火0.5 min,72℃延伸0.5 min,循环35次;最后72℃保温10 min。琼脂糖凝胶电泳并回收目标DNA片段,由大连宝生物工程有限公司完成测序,测序结果用BLAST软件在GenBank进行同源性比较,以Clustal X进行多序列比对后,用MEGA 4.0的Neighbor-Joining法构建系统发育树,并进行1000次Bootstraps检验。

2 结果与分析

2.1 淀粉降解菌株的分离

从表1可以看出,相同样品在淀粉培养基(S1)中出现菌落数最多,平均为11.5×107cfu/ g,显著高于淀粉蛋白胨酵母培养基(S2)和牛肉膏蛋白胨淀粉培养基(S3)的0.25×107cfu/g和0.25×107cfu/g。

表1 培养基对淀粉降解菌分离的影响(单位:107cfu/g)Table 1 Effect of starch degradation strains in different mediums(Unit:107cfu/g)

2.2 功能菌株筛选

采用透明圈法对淀粉降解菌进行筛选,从菠萝渣中分离了47个菌株,其中40个菌株没有任何降解能力。7个菌株有降解能力,其透明圈直径与菌落直径的比值在0.55～4.0,占分离比例的14.89%(表2)。7个功能菌株中,s2b7-4的比值最大为4.0,s2b7-1次之为2.57。

表2 菠萝渣淀粉降解菌的筛选Table 2 Screening of starch degrading-bacteria in pineapple residue

2.3 功能菌株复筛

通过采用透明圈法对获得的初始功能菌株进行复筛,从而确定淀粉降解功能菌株。实验表明: s2b7-4和s2b7-1菌株的HC值显然比其他菌株的大,分别为3.75和2.63,被确定为淀粉功能降解菌株(表3)。

2.4 功能培养基筛选

利用功能菌株在不同培养基上的HC值来评价菌株功能发挥的最适培养基。由表4可知: s2b7-1和s2b7-4菌株HC值在12种不同培养基表现不一,均在改良LB培养基上HC值最大,分别为5.05和2.43。故认为改良LB培养基是s2b7-1和s2b7-4菌株功能培养基。

表3 淀粉降解功能菌株筛选Table 3 Screening of starch degrading-bacteria

表4 s2b7-1和s2b7-4菌株在不同培养基HC值Table 4 HC value of s2b7-1 and s2b7-4 strains in different mediums

2.5 功能培养基优化

对s2b7-1和s2b7-4菌株的功能培养基即改良LB培养基中的蛋白胨、NaCl和酵母膏用量进行优化,其优化组分水平如表5所示。试验结果表明,s2b7-1菌株的最佳培养基为组合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,琼脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大为4(表6);s2b7-4菌株的最佳培养基为组合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏2.5 g,NaCl 2.5 g,琼脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大为3.08(表7)。

表5 培养基优化组分水平Table 5 Medium optimization component level

表6 s2b7-1菌株功能培养基优化结果Table 6 Medium optimization results of s2b7-1 strain

2.6 s2b7-1和s2b7-4菌株优化培养基的酶活

通过对s2b7-1和s2b7-4菌株分别在优化培养基上的淀粉降解酶的测定发现:s2b7-1和s2b7-4菌株的酶活性分别为216.46μg/(mL· min)和313.71μg/(mL·min),因此,综合初筛、复筛和酶活性测定,得出s2b7-4菌株对淀粉具有较强的降解能力。

2.7 功能菌株鉴定

2.7.1 形态特征 形态观察发现,s2b7-4菌落为圆形,黄色不透明,随着培养时间的延长,菌落变厚、变干,边缘锯齿状,菌落上有褶皱状突起,颜色变为浅棕黄色;菌体直杆状,大小为0.75μm× 2.10μm,周生鞭毛,革兰染色阳性;产芽胞。表明该菌株为芽胞杆菌(Bacillus sp.)。

2.7.2 生理生化特征 菌株s2b7-4生理生化测定结果(表8),菌株s2b7-4生长温度范围为15～45℃,生长的pH范围为5～9,能够耐受5%的氯化钠和0.001%的溶菌酶,参照文献[4-5],表明该菌株与枯草芽胞杆菌的特征基本相似,因此,菌株可能为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

表8 s2b7-4菌株的生理生化特征Table 8 Physiological and biochemical characteristics of s2b7-4 strain

2.7.3 分子鉴定 提取菌株s2b7-4基因组DNA,通过PCR得到菌株1.5 kb左右的16S rDNA。委托宝生物工程(大连)有限公司测得s2b7-4的16S rDNA部分序列,长度为1461 bp。通过BLAST比较发现:s2b7-4的16S r DNA序列与芽胞杆菌属细菌的16S r DNA相似,调出其中已鉴定菌株的16S rDNA,用Clustal W进行多重序列对比,用软件MEGA 4.0按Neighbor-Joining法构建系统发育树(图1)。菌株与枯草芽胞杆菌B.subtilissub sp.subtilis IAM 12118T(AB042061)关系最紧密,位于同一分支中,同源性高达99.4%。结合s2b7-4形态特征、培养特征及生理生化指标测定等表型鉴定结果,初步将s2b7-4菌株鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

图1 邻接法构建的s2b7-4菌株16S rDNA序列系统发育树Fig.1 Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of s2b7-4 strain

3 讨 论

本文以菠萝渣堆肥所需菌剂的开发为主,通过对多种分离源的淀粉降解菌进行分离、纯化和筛选,获得了1株淀粉降解功能菌株,并对其最佳培养基进行筛选。通过试验得出以下结论:①利用多种选择培养基,经过初筛和复筛,从自然发酵不同阶段的菠萝渣中获得了2株淀粉降解菌株s2b7-1和s2b7-4;②s2b7-1和s2b7-4菌株最佳功能培养基为改良LB培养基,并对培养基进行了优化,通过优化培养基上的淀粉酶活测定发现, s2b7-4菌株对淀粉降解具有较好的功效;③通过形态、生理生化和分子综合鉴定得出s2b7-4菌株为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。

[1]邓干然,张劲,李明福,等.我国菠萝叶纤维发展前景分析[J].中国麻业科学,2009,31(4):274-277.

[2]黄发新,詹云辉.菠萝皮渣酿制白兰地的初步研究[J].广西热作科技,1997,(2):31-35.

[3]杨礼富,谢贵水.菠萝加工废料—果皮渣的综合利用[J].热带农业科学,2002,22(4):61-70.

[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[5]RE布坎南,NE吉本斯.伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京:科学出版社,1984.

Screening of Functional Starch-Degrading Bacteria from Pineapple Dregs and Identification of s2b7-4

HE Jun-jun1,LUO Ping1,CHEN Yong-hui1,YI Run-hua2,L IQin-fen3
(1.Zhanjiang Res.Sta.,CATAS,Guangdong,524013;2. Guangdong Ocean Uni.,Zhanjiang,Guangdong,524088; 3.Envir.&Plant Prot.Res.Inst.,CATAS,Danzhou,Hainan,571737)

In order to accelerate the fermentation of pineapple residue,multiple starch-degrading bacteria were isolated from naturally fermented pineapple dregs using selective media in this experiment.Functional strains s2b7-1 and s2b7-4 that were capable of degrading starch in pineapple residue,were obtained through screening and re-screenings, an improved the most suitable medium LB and its optimized combination were also screened.Strain s2b7-4 was identified comprehensively as Bacillus subtilis according to its morphological,physiological,bio-chemical and molecular characteristics.

pineapple residue;functional starch-degrading bacteria;s2b7-4

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0060-05

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金环境与植物保护研究所资助项目(2009hzs1J033)

贺军军 男,研究实习员。研究方向为资源开发与利用。Tel:0759-2192696,E-mail:hbj46@163.com

＊通讯作者。Tel:0759-2166419,E-mail:luoping428@163.com

2010-10-23;

2010-11-12