生物膜胞外聚合物的检测技术与功能的研究进展

黄敏婷,陆 春

(中山大学附属第三医院,广东广州 510630)

生物膜胞外聚合物的检测技术与功能的研究进展

黄敏婷,陆 春＊

(中山大学附属第三医院,广东广州 510630)

生物膜胞外聚合物是黏附在生物膜周围,保证生物膜功能及完整性的生物合成聚合物。近几年,生物膜胞外聚合物的物理化学性质、生物功能及其检查技术备受关注。就生物膜胞外聚合物的组成、检测技术及功能几方面展开综述。

生物膜胞外聚合物;组成;研究方法与技术;功能

生物膜胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)是一种在生物膜中,使细胞与其他特殊物质凝聚、结合在一起的有机生物合成聚合物,主要黏附在微生物生物膜周围,保证生物膜功能及完整性的物质。EPS的产生是自然环境中生物膜的普遍特性,在原核与真核生物中均可发现[1]。本文就EPS近期的研究内容展开综述。

1 EPS的组成成分与其影响因素

EPS是三维的、胶样的、高度水合的混合物,主要由多种有机高分子物质组成,如多糖、蛋白、核酸、磷脂、褐藻酸、腐殖质以及其他多聚混合物,其中也不乏一些低分子无机物,如硫酸盐等,它们在某种程度上可极大地改变生物膜的结构与物理化学性质。EPS中的糖类主要包含:单糖、糖醛酸、氨基糖等;磷脂类包含:脂肪酸、甘油、磷酸酶、氨基乙醇、丝氨酸、胆碱等;腐殖质类包含酚类混合物等,不同种类的微生物群体,EPS成分有所不同[1]。Tsuneda[2]对27种异养需氧菌EPS的组成进行研究,发现多糖和蛋白质为EPS主要成分,占整个EPS质量的75%～89%,且多糖中的己糖、己糖胺、酮糖占有相当高的比重。从油井分离出来的一种嗜热细菌MS-1[3],其EPS也含有48.3%～54.5%多糖,多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例为2.04∶1.00∶0.89;而蛋白类占EPS的37.2%～42.4%,包括蛋氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、组胺酸和丝氨酸。而Jabbouri[4]认为EPS的性质与成分的多样性取决于微生物种类和培养条件,其研究发现多聚N-乙酰葡糖胺(PNAG)是表皮葡萄球菌EPS的主要成分,除PNAG和蛋白外,胞外磷壁质也是表皮葡萄球菌生物膜中一种新的组分。D′Abzac[5]从4种厌氧颗粒污泥的EPS中提取到了9种物质,主要为腐殖酸类物质、蛋白和多糖,其中小部分重要的无机物可占EPS干燥重量的22%～70%。可见,微生物种类决定了EPS的主要成分,但对多数的EPS而言,多糖与蛋白类物质仍然占了相当大的比例,因此,可根据不同微生物群体的EPS成分不同,有目的选择不同的标记物对EPS进行研究。

EPS的成分来源于不同的途径,如细胞活动分泌、细胞表面分泌、细胞溶解以及从外界环境吸收等,故影响以上途径的因素均可影响EPS的组成。Mitik-Dineva[6]研究了5种海洋细菌在2种玻璃表面的增殖情况,结果显示5种细菌在化学蚀刻、光滑的纳米玻璃表面黏附能力均增强,EPS分泌水平也相应增高,说明在不同材料上所形成的生物膜其EPS的组成也不相同。Jang[7]在比较硝化和去硝化2种情况下生物膜的变化时,发现去硝化作用可减少EPS的浓度(主要是可溶性的蛋白及高分子量碳水化合物浓度)和降低生物膜的疏水性,从而导致沉淀絮状物老化,影响生物膜的生物特性,说明不同的生物膜培养条件对EPS的组成也可造成重要影响。所以,在研究不同处理方式下对EPS的影响时,需考虑培养条件及环境等因素的影响。

2 EPS的研究方法与技术

EPS的检测技术主要有破坏性及非破坏性分析2种[1]。破坏性分析主要指通过各种方法提取出EPS主要成分,再运用各种技术对提取物进行分析研究,如D′Abzac[8]研究发现EPS提取物中的无机物成分及含量,极大地依赖于不同的提取方法和厌氧污泥的不同种类,使用离心法、超声波降解法、加热提取法均可获得相似的无机物构成比,而阳离子树脂交换法可使EPS提取物中的钠离子含量增加,化学提取法则容易使提取物被杂质或萃取剂污染。Ni[9]利用凝胶渗透色谱法(GPC)、荧光三维激发/发射矩阵光谱技术(EEM)和数学建模,对活性污泥中微生物所产生的EPS性质进行研究,结果可观察到EPS提取物的色彩层析谱中存在7个波峰,其中3个为多糖类物质,4个为蛋白类物质。Simon[10]提出利用尺寸排阻色谱法(SEC)及2个串连的色谱柱,对厌氧污泥颗粒中提取出来的EPS进行分析,可获得更详细的层析谱。而Park[11]的研究则说明了宏蛋白质组学(Metaproteomic)分析法是深入研究活性污泥EPS中蛋白质的有效方法,Metaproteomic分析法的原理主要是应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对蛋白质进行分离纯化,后再通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/ MS)对蛋白质进行鉴定和分析。这些技术虽然都有利于EPS主要成份的深入研究,但对EPS造成了不可逆的破坏而不利于动态观察。

在非破坏性分析方面,有电子显微镜、扫描探针技术、磁共振光谱法、共聚焦激光扫描显微镜等技术[1]。如Adav[12]提出选用7种不同的荧光染料,即标记核酸的SYTOX蓝、标记脂质的尼罗红、标记β-多糖的卡尔科弗卢尔白、标记α-聚糖的伴刀豆球蛋白A、标记蛋白的异硫氰酸荧光素、标记活细胞的SYTO63、用于监测钙水平的钙绿,对EPS的不同成分进行原位杂交标记后,采用共聚焦激光扫描显微镜(CLS M)和MATLAB软件,可对EPS进行定位、定量分析。有研究[3]说明透射电子显微镜、环境扫描电子显微镜也可用于高温情况下(如油田)观察微生物膜的轮廓以及EPS的形态结构。而Quilès[13]使用衰减全反射—傅里叶变换红外光谱技术(ATR-FTI R),观察到浮游细菌的代谢情况和生物膜形成的初始阶段,还发现蛋白、核酸和多糖的ATR-FTIR光谱数据变化与浮游细菌的生长、生理状态的改变相关联,提示这一过程可能伴随EPS主要成份的产生。Ivleva[14]则提出一种无需标记的极有潜质的非破坏性检测EPS的技术——拉曼显微镜技术(RM),利用RM可研究不同种类生物膜的化学性质,包括微生物的组分和EPS,主要原理为RM可与各种不同结构的生物膜相互作用,分析其化学成分及提供化学相关信息,其结果与CLS M分析结果有着较好的一致性,将两者联合更有利于生物膜成分复杂结构的深入研究。上述检测技术均有利于直观认识EPS的形态和结构,并能在各种处理下对EPS进行较好的动态追踪及观察,但是,在未知生物膜EPS主要成分的情况下,所选用的标记物能否特异性的结合目标物质,以及能否得到较全面的标记物对EPS各种成分进行标记等问题,尚待进一步解决。

3 EPS的功能与意义

EPS主要负责生物膜结构与功能的完整性,是决定生物膜物理化学与生物学性质的关键。EPS形成的胶样网状系统,有利于维持生物膜菌体相互凝聚在一起,调节生物膜表面的黏附,参与感染的建立,以及保护细菌免受环境中有害物质的侵扰。关于EPS还可能存在的功能,概括如表1[1]。

表1 EPS可能存在的功能Table 1 Selection of proposed effects due to microbial EPS

因EPS具有吸附能力(解毒作用),使得EPS常用于环境治理、污水净化等方面,如Kong[15]对4种不同的活性污泥的EPS(包括可溶解的和固定的)吸收染料酸性湖蓝A的能力进行研究,结果显示干燥厌氧污泥颗粒的吸收能力最强,且不同种类的污泥中可溶解和固定的EPS吸收能力也不相同,提示选用合适的菌种和反应模型可提高EPS的去污净化能力。而Tourney[16]在研究EPS的物理化学性质对锌离子吸附的影响时,却发现移除EPS对金属离子吸附能力的影响并不大,且EPS产生的溶解性有机碳(DOC)可降低生物膜对金属离子的吸收,提示工业应用中生物膜反应器里过量的EPS可能降低金属离子的清除效率。在医学方面,致病微生物生物膜的形成是慢性感染、耐药性产生等问题的重要原因之一,对致病微生物生物膜EPS功能的研究和利用,往往有助于消除生物膜或阻止生物膜形成。如I wai[17]研究发现极端嗜热菌生物膜EPS的主要成分饱和硅酸,可以促进细胞之间及细胞与培养皿间的相互作用,从而形成生物膜结构;并包绕生物膜细胞表面发挥维持生物膜完整性的功能。在保持生物膜完整性的基础上,EPS还可改变自身的组成与生物特性以协助生物膜系统适应环境的变化,如粘液性铜绿假单胞菌[18]在生物膜形成时可产生一些胞外酶,如EstA、LasB、LipC,可影响生物膜的形成与空间分布以适应环境的变化。同时,EPS有利于细菌抵抗宿主免疫的功能:Wagner[19]发现嗜中性粒细胞(P MN)趋于黏附生长阶段的铜绿假单胞菌生物膜,成熟的生物膜因不分泌3OC12-HSL而对PMN无趋化作用,其一系列的实验证实了成熟与生长阶段的生物膜主要区别在于EPS中海藻酸盐的有无,但生物膜深层细胞逃避宿主免疫攻击主要原因还是成熟生物膜的EPS限制了PMN的穿透,说明EPS有保护生物膜内部细菌、抵抗宿主免疫的屏障功能。还有研究[20]将可以表达生物膜降解酶的噬菌体转染至生物膜中的大肠埃希菌细胞内,重组噬菌体在细胞内大量复制并表达溶解酶DspB,最终致细菌溶解及EPS降解,生物膜被清除,体现了EPS在形成及维持生物膜状态中起着必不可少的作用。

4 结 语

由于生物膜广泛存在于日常生活、生产环境中,对生物膜胞外聚合物进行深入研究、了解生物膜的物理化学性质及生物特性,有助于人们将其灵活应用于工业生产、食品制造、污水处理、医学行业等各种领域,尤其是胞外聚合物在致病微生物生物膜中所起作用的深入研究,对医学上的临床治疗问题有着重要的指导意义。

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Detection and Function of Bio-Membrane Extracellular Polymer

HUANG Min-Ting,LU Chun
(The Third Affil.Hosp.of Sun Yat-sen Uni.,Guangzhou510630)

Bio-membrane extracellular polymer(BMEP)is a bio-synthesis polymer that sticks and attaches to the bio-membrane to assure the function and integrity of bio-membrane.Recently physicochemical and biological properties of BMEP and its detection technique were deeply paid close attention to.The components of BMEP,its detection technique,functions and other aspects were summarized in this article.

bio-membrane extracellular polymer(BMEP);component;detection method;function

Q73;Q93-33

A

1005-7021(2010)06-0082-04

黄敏婷 女,硕士研究生。研究方向为皮肤病与性病。Tel:020-85253017,E-mail:huangminting1985@yahoo.com.cn

＊通讯作者。E-mail:pifuke@126.com

2010-10-24;

2010-11-19