北极狐GH基因的单核苷酸多态性及其与生长性状的关联性分析

杜智恒，杨春山，白秀娟

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

随着毛皮动物养殖范围的扩大，北极狐已逐渐成为我国各地饲养场主要的饲养品种。为了增加我国北极狐的毛皮在国际市场上的竞争优势，各地饲养场不断加强育种及进行品种改良，并进行了科学饲养，从芬兰引进了优秀种狐同我国各饲养场的优秀本地狐进行杂交，以达到提高我国北极狐毛皮质量的目的。但是我国狐的毛皮质量与发达国家相比，仍然有一定的差距。这就使得提高狐的毛皮质量成为了人们研究的主攻方向，因此北极狐逐渐成为了研究的热点，尤其在分子方面的研究也越来越受到人们的关注。

目前对北极狐基因的研究多集中于微卫星方面的研究，而对一些核内重要的功能基因及其它们的生物学功能的探索则相对较少，目前仅见Graphodatsky等通过G显带方法对北极狐、赤狐和狗的染色体图谱进行了比较研究[1]；胡晓航对银狐的生长激素（GH）基因的cDNA进行了克隆测序的报道[2]。张敏等研究表明瘦素基因突变位点导致的基因型对北极狐的体重、腹围和皮张长度有极显著的影响（P<0.01），而其受体基因突变位点导致的基因型对胴体重和针毛长有极显著的影响（P<0.01）[3]。本文主要对生长激素（Growth Hormone，GH）基因进行了SNPs检测及与其生长性状的关联性分析。

生长激素（GH）是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，其成熟肽由190～191个氨基酸残基组成，不含糖基，分子质量约为22 ku[4]。生长激素基因由5或6个外显子和4或5个内含子构成[5]。它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统[6-7]，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调理蛋白质、糖及脂肪的代谢。GH作用机理复杂，影响动物机体蛋白质、脂肪和糖的代谢，与其生长发育、繁殖等密切相关。因此，GH已成为近些年在提高动物生长速度、生长性能等方面研究的热点之一。哺乳动物的GH基因研究得比较透彻，由5个外显子和4个内含子构成[8]。GH基因的研究首先是从大鼠和人开始的，随后在牛、羊、猪、猫、狗、大熊猫、豚鼠以及禽类的鸡、鸭、鹅、还有鱼类等动物中相继展开了研究。

例如，聂庆华等以粤黄鸡矮脚黄系等不同蛋鸡、肉鸡品种（系）作为试验材料研究GH基因的多态性，发现优质肉鸡、速生型肉鸡内含子1和4的等位基因的基因型频率和基因频率比较接近，而蛋鸡与它们的差别比较明显[9]。孙少华等做了关于肉牛生长激素基因与主要生产性能的研究，该研究是为了寻找主要生产性能（12月龄体重、6～12月龄日增重）与基因型效应的关系，以便进行标记辅助选择，达到肉牛良种早选、选准、提高肉牛生产性能的目的，并取得了初步的进展[10]。Ferraz等在对牛的生长激素基因进行多态性研究中在其5'侧翼序列共找到了6个新的SNPs[11]，这些SNPs将有助于对牛开展进一步的分子标记研究。说明该基因具有重要的研究价值。

目前对于狐狸生长激素基因方面的报道很少，尚未见有关北极狐生长激素基因方面的相关报道，在基因数据库中我们只检索到了银狐的GH基因cDNA序列，本实验也是根据该序列与UCSC上的狗的全基因组序列进行比对后设计的引物。

1 材料与方法

1.1 试验样品

所用实验动物为大兴安岭图强林业局狐貉养殖基地提供一年生北极狐，首先将5 mL的EP管事先装入75%的酒精，当狐场杀狐取皮的时候，用剪刀剪取死狐的腿部肌肉装入管中，置于-20℃冰箱中保存。另外，对已上楦板的狐皮进行采样时，则是从其左后爪上剪下一点皮毛装入1号封口袋内。

其中有296个个体均有处死时的体重、体长和腹围记录，但没有皮张长度记录；另外，选取412个个体，这些个体只有剥皮后的皮张长度记录。采样记录详见表1，部分样品详细记录见表2、3。

表2 试验样品体重、体长及腹围记录Table2 Records of sample weight,body length and abdominal circumference

表3 试验样品皮张长度记录Table3 Records of sample furriery length

1.2 DNA提取和检测

北极狐基因组DNA按SDS法提取，并溶于TE中，－20℃保存。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释成 50 ng·μL-1备用。

1.3 引物设计

根据GenBank上北极狐（Accession No.EU159 584）GH基因的cDNA序列和Ucsc上狗的全基因组进行Blast比对，找到5个外显子序列，根据这5个外显子序列共设计了6对引物。另外，根据内含子2又设计了4对引物。引物序列见表4。

表4 GH基因PCR-SSCP的引物序列、产物大小及位置Table4 Primer sequences，corresponding PCR product size and position for GH PCR-SSCP

1.4 PCR扩增

反应物组成：共25 μL体系，其中包括：灭菌去离子水 16.3 μL，50 ng·μL-1的 DNA 模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1的 dNTP 2.0 μL，10 pmol·μL-1的上下游引物各 1 μL，0.5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶 0.2 μL。

由于特异性引物的TM值和GC含量的差异，因此每对引物复性的温度有所不同。各引物的PCR反应循环参数均为：94℃预变性7 min；之后35个循环：94℃变性30 s，50～60℃复性40 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸10 min。

1.5 PCR-SSCP检测多态

在16%的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳条件下对PCR产物进行单链构像多态性分析。

1.6 统计模型与分析

根据本研究试验群体的特点，构建如下线性回归模型：

模型 1：y＝μ+G+S+G*S+e

模型 2：y＝μ+G+e

y为性状观察值，μ为群体均数，G为基因型固定效应，S为性别观察值，G*S为基因型与性别的互作效应，e为随机效应。对于模型1使用统计软件JMP7.0检验基因型与公母狐整个群体性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值；对于模型2使用统计软件JMP7.0分别检验基因型与公母狐群体性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。

2 结果与分析

2.1 引物Gh2的多态性分析结果

2.1.1 PCR扩增结果

针对该基因我们共设计了10对引物进行PCR-SSCP检测，以北极狐的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测，结果发现各对引物特异性扩增良好，片段长度均与预期的片段大小一致，经过在不同浓度聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳条件下进行SSCP分析，结果表明只在Gh2、IGH2和IGH4这3对引物中检测到了多态，其余7对引物均没有检测到多态。

引物Gh2以北极狐的基因组DNA为模板进行PCR扩增，片段长度与预期的片段大小一致（158 bp左右）（见图1），可以用来进行SSCP分析。

2.1.2 SSCP检测结果

在16%的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳条件下进行SSCP分析，结果表明，在不同个体中检测到了3种基因型，分别命名为AA型、BB型和AB型（见图2）。分别取两个AA型和两个BB型个体进行回收克隆测序，通过测序结果同源性比较发现，在该序列的第81位点处发生了（G-A）转换，将与GenBank中序列（Accession Number.EU159584）一致的纯合子命名为BB型，另外一种纯合子定义为AA型（见图3）。通过序列分析表明，该点突变并没有导致氨基酸上的变化，属于同义突变。

2.2 引物IGH2的多态性分析结果

2.2.1 PCR扩增结果

引物IGH2以北极狐的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖胶检测，结果发现特异性扩增良好，片段长度与预期的片段大小一致（180 bp左右）（见图4），可以用来进行SSCP分析。

2.2.2 SSCP检测结果

将引物CGH2所测4个个体的序列用DNAMAN进行同源性比较发现，在186位点和239位点处分别发生了（C-T）和（T-C）转换，引物IGH2正是针对这两个突变位点设计的。在16%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳条件下进行SSCP分析，结果表明，在不同个体中检测到了5种基因型（见图5），分别命名为CC型、DD型、EE型、CD型和CE型。我们将与GenBank中序列（EU376045）一致的纯合子命名为CC型，另两种纯合子分别命名为DD型和EE型（见图6）。但是由于DD型与DE型可能存在区分不开的问题，所以在接下来的统计中，我们仅针对C186T这个突变位点导致的CC、EE和CE这三种基因型进行分析。

2.3 引物IGH4的多态性分析结果

2.3.1 PCR扩增结果

根据GenBank上北极狐（Alopex lagopus）GH基因的DNA序列（EU376045），在其第二内含子和第三外显子上设计引物IGH4，以北极狐的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖胶检测，结果发现特异性扩增良好，片段长度与预期的片段大小一致（169 bp左右）（见图7），可以用来进行SSCP分析。

2.3.2 SSCP检测结果

将引物CGH2所测四个个体的序列用DNAMAN进行同源性比较发现，在583位点处分别发生了（C-A）颠换，引物IGH4正是针对这个突变位点设计的。在16%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳条件下进行SSCP分析，结果表明，在不同个体中检测到了3种基因型（见图8），分别命名为FF型、GG型和FG型。我们将与GenBank中序列（EU376045）一致的纯合子命名为FF型，另一种命名为GG型（见图9）。通过序列分析表明，该点突变没有导致氨基酸变化，属于同义突变。

2.4 GH基因多态性与北极狐生长性状的相关分析

2.4.1 GH基因多态性与北极狐整个群体生长性状的相关分析

以大兴安岭图强林业局养狐场的北极狐为试验群体，对GH基因的多态性与生长性状进行最小二乘分析。结果发现GH基因不同区域的SNPs对北极狐的生长性状有一定的影响，结果见表5。其中第2外显子的G81A突变位点（Accession Number.EU159584）对北极狐的皮张长度性状有一定的影响趋势（P<0.2）；第3外显子的C583A突变位点对北极狐的体重、体长、腹围和皮张长度性状均有一定的影响趋势（P<0.2）。

2.4.2 GH基因多态性分别与公母狐生长性状的相关分析

以大兴安岭图强林业局养狐场的北极狐为试验群体，对GH基因的多态性与生长性状进行最小二乘分析。结果发现GH基因不同区域的SNPs对公母北极狐的生长性状有一定的影响，见表6。其中第3外显子的C583A突变位点对公狐的体重性状和皮张长度性状均有一定的影响趋势（P<0.2），而对公狐的体长性状则影响显著（P<0.05）。

表5 GH基因多态位点对北极狐生长性状的影响（P值）Table5 Effects of GH gene polymorphisms on arctic fox growth traits(P value)

表6 GH基因多态位点对生长性状的影响（P值）Table6 Effects of GH gene polymorphisms on growth traits(P value)

GH基因（外显子3）C583A突变与公狐体长性状的相关分析，公狐FF、FG、GG基因型个体间体长性状的多重比较结果表明，FG基因型个体体长显著大于FF基因型个体（见表7）。

表7 C583A突变对公狐体长的影响（最小二乘均值）Table7 Effects of different genotypes of C583A mutant on male fox body length(LSM)

3 讨论与结论

生长激素作用机理复杂，影响动物机体蛋白质、脂肪和糖的代谢，与其生长发育、繁殖等密切相关。因此，GH是近些年在提高动物生长速度、生长性能等方面研究的热点之一。另外，对QTL的检测和利用是实现从分子水平上对控制畜禽重要经济性状的基因进行操纵的关键。在寻找畜禽重要经济性状的连锁标记的过程中，候选基因法是一种非常有效的方法，它不仅能够寻找到那些与性状相连锁的间接标记（Indirect Marker），而且还有可能寻找到影响性状的直接标记（Direct Marker），即控制该性状的基因[12]。Malveiro等发现，Algarvria山羊5个外显子上均存在单链构型多态性（SSCP），且3个外显子多态性与奶山羊产奶量、脂肪量和乳蛋白量显著相关[13]。NTE等研究发现生长激素基因对鸡的生长和屠体性状均有影响[14]。胡沈荣等对5个山羊品种的GH基因的第2、5外显子的多态性进行了研究，发现山羊GH基因外显子5位点频率分布与品种特性显著相关，且该区域对产奶量有显著影响。同时，外显子2区域对产羔数有显著影响[15]。俞沛初等对大约克夏猪、上海白猪、巴马香猪三个猪种生长激素基因的多态性进行了研究，发现了可能是小型猪的有利基因型[16]。综合以上这些结果可以认为，GH对动物的生长发育具有重要的作用。

本研究首先依据GH基因在畜禽生长过程中的关键作用，将GH基因确定为可能影响北极狐生长性状的候选基因。然后在大兴安岭图强林业局北极狐群体中研究了GH基因三个位点的多态性对整个群体生长性状的影响和这三个位点的多态性分别对公母狐群体生长性状的影响。检测结果表明，北极狐GH基因第2外显子的G81A突变位点（Accession number.EU159584）对整个群体的皮张长度性状有一定的影响趋势（P<0.2）；但针对该点分别对公母狐进行研究时发现，该突变位点导致的三种基因型对公母狐的皮张长度性状均没有影响。说明该位点对北极狐皮张长度性状具有一定的影响，但这种影响在性别上没有偏向性。同时，该基因第3外显子的C583A突变位点对整个群体的体重、体长、腹围和皮张长度性状均有一定的影响趋势（P<0.2）。而且在公母狐群体中对该点的研究发现，此突变导致的FF、FG、GG三种基因型对公狐体长性状有显著影响（P<0.05）。说明就体长性状来说，该点在公狐群体中发挥的作用要大于在母狐群体的作用。可以应用该标记位点对公狐的体长性状进行标记辅助选择，这将有助于加速北极狐的分子育种进程。

在统计学中，常常需要定义显著水平。显著水平的大小要依据具体的试验而定。在生物学试验的统计中，通常把0.05定义为显著水平。但有时在对试验要求不太严格或难以获得较大样本等情况时，可以将这一标准放宽。如我们在对候选基因与生产性状的关联分析的研究中，常常把小概率P<0.05定义为因素对指标有显著影响，而把P<0.2定义为有影响，这样做的目的是尽可能避免把那些实际上对目标性状有显著影响而一次试验未能达到P<0.05显著的基因错误的排除掉。如在Li等的论文中就是如此[17]。

从以上分析结果可以看出，GH基因可能是影响北极狐体长性状的主效基因或与影响该性状的主效基因紧密连锁。

[1]Graphodatsky A S,Yang F,Serdukova N,et al.Dog chromosome-specific paints reveal evolutionary inter and intrachromosomal rearrangements in the American mink and human[J].Cytogenet Cell Genet,2000,90:3-4.

[2]胡晓航.银狐生长激素基因克隆与基因表达研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2005.

[3]张敏,杜智恒,白秀娟.瘦素及受体基因多态性与北极狐生产性能相关性分析[J].东北农业大学学报,2009,40(9):75-81.

[4]Chen H C.Purification and characteristics of porcine growth hormone[J].Biol Chem,1970,2453:402-407.

[5]宋成义,经荣斌.畜禽GH基因多态性与生产性能相关研究进展[J].国外畜牧科技,2000,4(27):25-27.

[6]孙逊,朱尚权.生长激素的结构与功能[J].国外医学生理、病理科学与临床分册,1999,19(1):6-9.

[7]Strobl J S,Thomas M J.Human growth hormone[J].Pharmacological Reviews,1994,46:1-34.

[8]贺淹才.生长激素和生长激素受体的分子生物学[J].生命的化学,2002,22(1):29-32.

[9]聂庆华,张细权,杨关福,等.鸡生长激素基因的PCR-RFLPs分析[J].农业生物技术学报,2001,9(3):282-285.

[10]孙少华,李雪梅,魏学蕊,等.肉牛生长激素基因HaeⅢ座位多态性与主要生产性能的相关研究[J].中国畜牧杂志,2002,38(2):15-17.

[11]Ferraz ALJ,Bortolossi JC,Curi RA,etal.Identification and characterization of polymorphisms within the 5'flanking region,first exon and part of first intron of bovine GH gene[J].Animal Breeding and Genetics,2006,123(3):208-212.

[12]Jack C M,Frederic H.The use of molecular genetics in the improvement of agricultural populations[J].Nature Reviews,2002,3:22-32.

[13]Malveiro E,Pereira M,Marques P X,et al.Polymorphisms at the five exons of the growth hormone gene in the algarvia goat:possible association with milk traits[J].Small Ruminan Research,2001,41:163-170.

[14]Nie Q,Sun B,Zhang D,et al.High diversity of the chicken growth hormone gene and effects on growth and carcass traits[J].Heredity,2005,96(6):698-703.

[15]胡沈荣,蓝贤勇,陈宏,等.5个山羊品种GH基因第Ⅱ、V外显子的多态性及其应用[J].西北农林科技大学学报,2007,35(12):12-15.

[16]俞沛初,郭传甲.三个猪种生长激素基因的多态性分析[J].养猪,2008(1):23-24.

[17]LiH,DeebN,Zhou H,et al.Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with transforming growth factor-β genes[J].Poultry Science,2003,82:347-35.