柑桔皮中黄酮类化合物的提取及抗氧化作用研究

刘立新，张羽男，沙靖全*，李 睿

（1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

柑桔属芸香科柑桔亚科，是热带、亚热带常绿果树，用作经济栽培的有3个属，枳属、柑桔属和金柑属。

我国和世界其他国家栽培的柑桔主要是柑桔属[1]。一直以来柑桔作为药用植物深受中医的青睐，桔皮理气健脾，燥湿化痰；桔络通络理气化痰；桔核理气散结止痛；桔叶疏肝解郁，行气散结，消肿化痰。但对其功效研究报道较少，柑桔中富含糖、酸、维生素C、矿物质元素，还含有类黄酮、类胡萝卜素、类柠檬苦素等活性物质，其中类黄酮是柑桔中含量最为丰富、种类最多的一类功能活性成分。黄酮类化合物是一类以黄酮为母核的化合物，广泛存在于植物界中，目前已发现有5 000多种植物中有黄酮类和异黄酮类物质。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，具有高抗氧化性，低毒性，无不良反应，同时还有显著的清除人体内自由基、抗老化、抗突变等保健功能[2]，它是一类具有广阔开发前景的天然抗氧化剂。本文对柑桔皮中黄酮类物质的提取及其抗氧化作用进行了研究，为利用柑桔皮工业化生产黄酮类药用成分提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

取成熟的东莞小叶柑桔外皮，70℃烘干，粉碎，备用。

1.2 主要试剂

芦丁标准品（含量为98%）（上海生化制剂厂）；硫代巴比妥酸（TBA）（国药集团化学试剂有限公司）；乙醇，石油醚，三氯甲烷等均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 原料的预处理

原料预先进行石油醚脱脂、脱色素，以排除干扰。将柑桔皮粉用索氏提取法（石油醚为抽提剂，85℃水浴）脱脂及脂溶性色素，当虹吸管中石油醚提取液无色时挥尽桔皮粉中石油醚，烘干，备用。

1.3.2 提取因素及其条件的确定

为全面考察乙醇提取法的工艺参数及最佳操作条件：确定以乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度L9（34）进行正交试验设计，通过测定柑桔皮供试品中的总黄酮提取率，确定最佳提取工艺条件。试验确定的因素水平见表1。

表1 试验因素水平Table1 Factors and levels of experiment

1.3.3 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并加至刻度。分别精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mL 分置于50 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，混匀，放置6 min，再加10%硫酸铝溶液1.5 mL，混匀，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm的波长处测定吸光度。用最小二乘法进行线性回归，得芦丁溶液浓度（C）与吸光度值（A）关系曲线的回归方程式：y=5.5045x+0.0053，r=0.9974。

1.3.4 提取物中黄酮类化合物含量的测定

分别取一定量的待测提取液，置于50 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，混匀，放置6 min，再加10%硫酸铝溶液1.5 mL，混匀，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，用紫外分光光度计，1 cm比色皿在350～600 nm波长范围内扫描，在510 nm处有最大吸收，故在510 nm的波长处测定提取物的吸光度。

1.3.5 提取物的精制

采用萃取法对提取物进行精制[3]。称取柑桔皮粉40 g，在优化的最佳提取工艺条件下进行提取。然后将提取液放在旋转蒸发器中减压浓缩至1/3后将滤液在70℃水浴上蒸干，所得固体加入水20 mL溶解，再加入三氯甲烷20 mL，振摇，转入分液漏斗，静置，分层，弃去三氯甲烷层，水溶液再加入三氯甲烷20 mL重复1次，将水层减压蒸馏，浓缩，再在水浴上蒸至近干，干燥，得精制品，备用。

1.3.6 TBA法测定柑桔皮黄酮抑制芝麻油的过氧化作用

先将柑桔皮黄酮用无水乙醇配置成浓度分别为0.20%、0.10%、0.05%的溶液，然后将配置好的黄酮溶液和蒸馏水各4 mL放入不同的具塞试管中，加入4.1 mL体积分数为2.5%芝麻油，8 mL pH 7.5磷酸缓冲液和3.9 mL无离子水，混匀后置于40℃的培养箱中，每隔24 h取待测样品1 mL，加入1 mL 20%的三氯乙酸，混匀，放置15 min后，加入2 mL 0.3%的TBA（用0.5%三氯乙酸配制），于沸水

式中，POV为样品的过氧化值（mmol·kg-1）；

V1为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积（mL）；

V2为空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液体积（mL）；

M为硫代硫酸钠标准溶液的物质的量浓度（mol·L-1）；

m为样品质量（g）。浴中加热15 min，取出室温下冷却后加入4 mL正丁醇，摇匀，于3 000 r·min-1离心15 min，取上层正丁醇液，于532 nm比色测定样品的吸光度A值。

1.3.7 柑桔皮黄酮类化合物在猪油中的抗氧化作用

采用烘箱储藏法测定提取物对猪油自氧化的抗氧化能力[4]。称取粗黄酮粉0.01、0.05、0.20 g，各用4 mL无水乙醇溶解后分别加到20 g温热猪油中，搅匀，以不加桔皮黄酮粉，仅在20 g猪油中加入4 mL无水乙醇为对照样，在70℃烘箱中强化保存，定时搅伴，于不同时间取样测定猪油中的过氧化值（POV），并以此来表示猪油的氧化速度，进而衡量柑桔皮黄酮类化合物的抗氧化活性。过氧化值的测定按滴定法进行[5]。

样品的过氧化值（POV）计算：

2 结果与分析

2.1 提取柑桔皮黄酮类化合物的最佳工艺选择

根据表1以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、固液比（C）、提取温度（D）4个因素为影响因素，以黄酮类化合物提取率为考察指标，进行L9（34）正交试验，结果见表2。

表2 正交试验结果Table2 Result of orthogonal experiment

由表2可以看出，柑桔皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺为A3B1C3D3，即乙醇浓度70%，提取时间1.5 h，固液比1：20，提取温度80℃。乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度4个因素对黄酮类化合物提取率影响的主次顺序为：固液比>提取时间>乙醇浓度>提取温度，且随料液比和乙醇浓度的增加，提取率增加。经验证试验得出该条件下提取出的黄酮类化合物为柑桔皮干重的2.689%。

2.2 柑桔皮类黄酮化合物抑制芝麻油的过氧化作用（硫代巴比妥酸法）

按照硫代巴比妥酸法测定的吸光度值如表3所示。

表3 不同浓度柑桔皮黄酮溶液与抗氧化性关系Table3 Relationship between different concentration of flavone of orange peel and antioxidation

TBA法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，产生过氧化自由基，进而氧化生成环氧化物，后者生成丙二醛，1分子的丙二醛可同2分子的TBA作用生成有色化合物，该有色化合物在530 nm左右有吸收峰[6]。由表3可以看出，添加桔子皮黄酮的溶液较不添加的对照样吸光度值低，且添加不同浓度的柑桔皮黄酮溶液所测得的吸光度值不同，由此可以看出黄酮添加量大的抑制芝麻油的自动氧化时间长。

2.3 POV值测定法

不同浓度的黄酮溶液POV值随时间变化情况如表4所示。

由表4和图1可以看出，相对于对照样，柑桔皮中提取的黄酮类化合物对猪油的自氧化有明显的抑制作用，即桔皮黄酮粉添加到猪油后，POV值下降。并且随添加量的增加，抗氧化能力也随之增强，在试验剂量范围内呈正相关。

表4 柑桔皮黄酮对猪油的抗氧化作用Table4 Antioxidation of flavone of orange peel to lard oil

图1 不同桔皮黄酮添加量与抗氧化性关系Fig.1 Relationship between different addition of flavone from orange peel and antioxidation

3 讨论

3.1 柑桔皮黄酮类化合物的提取工艺

黄酮类化合物在植物体内以苷或苷元的形式存在。在大多数情况下，用有机溶剂可将苷或苷元全部提出，提取黄酮类化合物常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，但由于甲醇、丙酮等的毒性较大，因此一般采取乙醇为提取溶剂。李志洲研究了苦瓜中黄酮类化合物的乙醇提取工艺[7]，通过试验确定最佳提取工艺条件为乙醇浓度90%，提取时间3 h，固液比1：60，提取温度70℃，提取率可达7.128%。本研究以乙醇为溶剂从柑桔皮中提取黄酮类化合物，以固液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度为影响因素，黄酮类化合物的提取率为2.689%，比沙枣中、金橘皮中黄酮提取率要高。在试验过程中发现随料液比的增加，提取效果越好，这是因为料液增加，浸出成分相应增加，黄酮类化合物在大剂量的溶剂中始终成“稀”溶液的状态，利于扩散的进行；随乙醇浓度的增加，提取率增加，说明黄酮类化合物醇溶性好；提取时间太短，黄酮类化合物不能完全浸出，但是时间过长可能会由于长时间在较高温度下浓缩黄酮类成分遭到破坏，反而使提取率降低；提取温度对黄酮提取率影响较小。

3.2 柑桔皮类黄酮化合物的抗氧化作用

广泛存在于植物中的黄酮类化合物具有抗溃疡、抗菌、抗炎、抗氧化、治疗心脑血管疾病等药用保健功能，是一类具有广阔开发前景的天然抗氧化剂。崔永明等以POV为指标[8]，采用烘箱法研究了甘草总黄酮对油脂的抗氧化性能。结果表明，甘草总黄酮对四种食用油脂（菜籽油、大豆油、花生油、猪油）均有良好的抗氧化效果，且对猪油具有较强的抗氧化作用，其作用具有剂量效应关系；杨建雄等用硫代巴比妥酸法研究柿叶黄酮的抗氧化效果[9]。结果表明，柿叶黄酮可以抑制·OH所致丙二醛的产生，减轻肝线粒体膨胀程度。本研究通过利用所提取的黄酮类化合物对芝麻油和猪油进行抗氧化试验，发现添加柑桔皮黄酮类化合物的芝麻油与TBA反应后其吸光度降低，表明TBA染料生成得少，说明抗氧化作用抑制了自由基链反应的进行。在测定POV值试验中添加黄酮粉后在开始阶段，相对对照样而言，各样品的POV值皆下降，表现出明显的降低猪油中过氧化值的作用，随着时间的延长抗氧化性减弱，可能是由于长时间处于高温下，黄酮类化合物的成分遭到破坏而造成的。柑桔皮类黄酮化合物之所以能表现出良好的抗氧化作用可能是因为黄酮类化合物具有多酚结构，能够提供活泼的氢质子与油脂氧化产生的自由基结合成稳定的产物，从而阻止油脂的氧化反应循环。

4 结论

柑桔皮中黄酮类化合物的含量较高，在乙醇浓度70%，提取时间1.5 h时，固液比1：20，提取温度80℃的条件下提取的黄酮类化合物为柑桔皮干重的2.689%，比沙枣、金橘皮中黄酮类化合物含量高。柑桔皮黄酮类化合物能阻断油脂的自氧化过程，具有良好的抗氧化作用的能力。可将其应用于抗衰老，抗高血脂药物研究中，进一步开发其药用价值。

[1]叶兴乾.柑桔综合加工利用[M].1版.北京:中国轻工业出版社,2005:13-25.

[2]孔琪,吴春.菊花黄酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草药,2004,35(9):1001-1002.

[3]陈乃富,张莉.蕨菜黄酮类化合物的提取与分析[J].中国林副特产,2004(6):1-4.

[4]陈乃富.蕨菜黄酮类化合物的提取及其抗氧化作用[J].食品与发酵工业,2003,29(11):63-66.

[5]赵新淮,张娜,王琳.油脂过氧化值的碘量测定法比较研究[J].中国油脂,2003,28(4):60-62.

[6]于晶,郝再彬,苍晶,等.黄酮类化合物的活性研究进展[J].东北农业大学学报,2008,39(12):125-130.

[7]李志洲.苦瓜中黄酮类化合物的提取及抗氧化性研究[J].中国生化药物杂志,2007,28(4):264-266.

[8]崔永明,余龙江.甘草总黄酮对油脂抗氧化作用研究[J].食品科学,2007,28(11):119.

[9]杨建雄,原江锋.柿叶黄酮的体外抗氧化作用研究[J].营养学报,2003,25(2):215.