苦参素抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤作用的研究

高鹏

苦参素(matrine)是从豆科植物苦参的干燥根中提取分离精制而得的白色结晶性单体粉末。已有研究表明苦参素具有抗炎、免疫调节、减轻肝脏炎症活动、抑制肝内胶原合成及抗纤维化作用[1-2]。本实验通过大鼠肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)模型，探讨苦参素对缺血再灌注肝脏细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物与试剂 苦参素注射液购于江苏正大天晴药业股份有限公司，产品批号0511101。Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫组织化试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。

1.2 动物分组与模型建立 8～10周SD大鼠30只，♀♂不限, 体重200～250克。随机分为空白对照组(S组)、缺血再灌注+生理盐水组(I/R组)、缺血再灌注+苦参素注射液组(M组)，每组10只。大鼠于术前禁食12h,自由饮水。腹腔注射20%乌拉坦0.6ml/100g麻醉后，仰卧位固定，行颈部正中切口，钝性分离出一侧颈内动脉，插管以备取血。然后在剑突下行正中腹部切口3～4cm，打开腹腔，暴露肝门，用无损伤血管钳夹闭门静脉、肝动脉造成全肝缺血30min后，松夹恢复血流再灌注2h。S组和I/R组于术前30min分别经股静脉输注生理盐水2ml/100g，而M组于术前30min经股静脉输注苦参注射液2ml/100g。术毕处死, 取肝组织置于4%甲醛溶液中固定。

1.3 指标检测及方法 HE观察组织超微结构改变：取肝组织左叶剪成0.5cm×0.3cm×1.0cm置于4%甲醛溶液中固定24h后，经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，切成4～6um的切片，HE染色，中性胶封固，显微镜观察。

Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达检测:石蜡切片经脱蜡水化后,滴加3%H2O2灭活内源性酶, 双蒸水漂洗3次后,进行热修复抗原、滴加抗原修复液Ⅰ和正常山羊血清封闭液，室温孵育20min后，切片分别滴加Caspase-3及Bax、Bcl-2单克隆抗体，37℃孵育60min,同样以PBS漂洗2分钟×3次,再滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃孵育20min其间以PBS漂洗2分钟×3次。接着滴加SABC37℃孵育20min其间以PBS漂洗5分钟×4次。最后以DAB显色,苏木素复染后,封片光镜下观察。用PBS做阴性对照。结果判定：细胞浆内和细胞核膜上出现棕黄色颗粒或匀质样棕黄色结构为Caspase-3、Bcl-2和Bax免疫反应阳性细胞。各例切片于光镜下观察10个高倍视野，用BI2000医学图象分析系统测定每组Caspase-3、Bcl-2和Bax平均光密度值(OD值)。

2 结果

2.1 光镜下见S组肝小叶、肝细胞、枯否氏细胞及窦内皮细胞形态正常，窦间隙清晰可见。I/R组肝细胞大小不一，小叶周边窦间隙变窄，甚至消失，肝细胞脂肪变性非常明显。M组肝脏较I/R组明显减轻，偶见水肿、变性，小叶周边窦间隙清晰可见。

2.2 免疫组化法检测Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达镜下观察表明，凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3主要在肝脏细胞的胞浆表达,呈棕色反应,胞核基本不表达。M组Bax OD值明显低于I/R组(P＜0.05)，略微高于S组(P＞0.05)，而I/R组Bax OD值显著高于S组(P＜0.01)；I/R组Bcl-2 OD值高于S组(P＜0.05)，且M组Bcl-2 OD值高于S组(P＜0.05)，M组中Bcl-2表达虽强于I/R组,但两组之间比较差异无显著性; I/R组Caspase-3 OD值明显高于S组(P＜0.01)，且明显高于M组(P＜0.01)(见表1) 。

表1 各组中Bax、Bcl-2和Caspase-3 OD值比较

3 讨论

HIRI是肝部分切除及肝移植的主要制约因素之一[3],是导致患者死亡的主要原因。它是指各种原因导致肝血流中断或不足使肝脏缺血，当恢复血供再灌注后，肝细胞功能代谢障碍及结构破坏反而加重。本实验HIRI模型通过阻断全肝血流30min后恢复血流造成肝脏的损伤，从而出现肝细胞的变性和坏死。资料显示[4]，HIRI与内皮素/一氧化氮的失衡，核因子-kB(NF-kB)的激活，前炎性因子和粘附因子的释放，氧源性自由基的产生和中性粒细胞的聚集，肝细胞凋亡等因素密切相关。

以往认为坏死是HIRI后细胞死亡的唯一方式，近年来,大量研究资料表明，引起细胞死亡的方式可通过凋亡和坏死两条途径。凋亡是HIRI后细胞死亡的主要方式，HIRI后细胞凋亡的发生与缺血的严重程度、再灌注时间的长短有关。再灌注能加速细胞凋亡的进程。目前人们对HIRI时细胞凋亡的发生机制研究颇多，尤其是多种基因参与细胞凋亡的调控如bcl-2家族、Caspase家族、TNF受体家族和即早基因(IEGS)家族等。研究表明[5]，脂质过氧化、Bcl-2/Bax和Caspase-3参与肝脏缺血再灌注后细胞损伤过程，并在其中起重要作用。Bcl-2的功能可被结合蛋白所改变，Bax蛋白是同一细胞内Bcl-2的同源基因，二者作用相互拮抗。Bax可与Bcl-2蛋白结合成异二聚体并使之失活，加强表达Bax形成同二聚体将加速细胞死亡。所以Bcl-2和Bax表达水平的平衡结果决定了凋亡信号刺激后细胞存活或凋亡。而Caspase-3是细胞凋亡的效应分子,它在各种生理和病理因素刺激下,通过其家族成员的级联放大,实施细胞的凋亡, 引起细胞特征性的凋亡形态学上的改变,加重组织或器官的功能损害。有研究发现，HIRI后Bcl-2表达减弱，Bax表达增强，Bcl-2/Bax下降，表明Bcl-2、Bax参与了肝脏保存再灌注中细胞凋亡的调控。因此，通过抑制缺血再灌注过程中细胞凋亡能够保护肝脏功能。苦参素系由中药苦豆子中提取的生物碱类，大量研究表明，苦参素有抗HBV作用[6-7]，能消除自由基、保护免疫功能、抗细胞纤维化作用[1-2]。本研究证实：I/R组Bcl-2表达减弱，Bax表达增强，Bcl-2/Bax下降；苦参素组能使Bcl-2表达增强，Bax表达降低，Caspase-3表达也明显减弱，提示该药具有抑制肝细胞凋亡和改善肝功能作用，有利于预防HIRI。鉴于苦参素无明显毒副作用，有望成为很有前途的保护肝脏药物，其临床疗效还有待进一步深入研究。

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