HPLC法检测耳聋左慈丸中马钱苷方法研究

陆旋 张星海 黄雪梅

(浙江经贸职业技术学院应用工程系 浙江 杭州310018)

分析测试

HPLC法检测耳聋左慈丸中马钱苷方法研究

陆旋 张星海 黄雪梅

(浙江经贸职业技术学院应用工程系 浙江 杭州310018)

目的：建立以HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷的含量方法。方法：采用Agilent 1100高效液相，以波长240 nm，柱温20℃，流速1.0 mL/min，进样量20 uL；从色谱柱种类、流动相种类等方面来筛选马钱苷检测条件；从线性范围、回收率、精密度、重现性及稳定性等方面进行考察。结果：以Hypersil ODS C18柱(5 um,250 mm×4.60 mm)色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）为流动相检测效果良好。该方法在0.1272～3.18 μg内线性关系良好（R2=0.9994），进样精密度良好（RSD=0.4%，n=6），进样重现性良好（RSD=0.5%，n=6），准确度良好（平均回收率为99.6%，RSD=0.5%，n=6），稳定良好（在27 h内检测7次，RSD为0.7%，n=7)。结论：本法简便、准确可靠、专属性强，重现性好。

马钱苷；耳聋左慈丸；HPLC；质量分析

耳聋左慈丸为药典品种，是根据中医学理论，由山磁石、熟地黄、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮、山药等中药加工成的纯中药制剂，具有滋肾平肝的功效，用于肝肾阴虚耳鸣耳聋，效果显著[1-4]。耳聋左慈丸是目前广泛使用的一个制剂，处方中山茱萸药材主要含有马钱苷、熊果酸、齐墩果酸等有效成分，马钱苷是山茱萸的活性成分有效成分。山茱萸中的熊果酸和齐墩果酸是用用薄层色谱来检测的，马钱苷本实验是用液相来检测。本研究以马钱苷为主要研究指标，内容包括线性范围，精密度，重复性，稳定性，回收率，样品含量测定等方面，建立了HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷含量方法。

1 材料

1.1 实验原料

耳聋左慈丸（杭州胡庆余堂药业有限公司提供，生产批号分别是：060401、071211、071212、080201；三九黄石制药厂提供，生产批号分别是：080301、 080505、080603；北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂提供，生产批号分别是：4030020、4030306、4030307、5013094、5013066、5013013）。

1.2 实验试剂

乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸、醋酸均为分析纯。马钱苷对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：111640-200502，供含量测定用）。

1.3 实验仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1100)；紫外可见分光光度计(TU-1901)；电子天平(METTLER AG-285)。

2 方法

2.1 检测准备

2.1.1供试品溶液制备

取本品，研细，精密称取1 g，精密加入80%甲醇25 mL，称重，水浴回流60 min，放冷，称重，加入80%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2阴性样品溶液制备[5]

取缺山茱萸的耳聋左慈丸样品1 g,同法制成阴性对照溶液。

2.1.3 对照品溶液制备[6]

取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4色谱条件

色谱柱：依利特 Hypersil ODS-C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)柱号：E1523089；Kromasil 100-5 C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)E 34067；SHIMADZU VPODS C18 (5 μm,250 mm×4.60 mm)serial No. 6122225；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）；检测波长为240 nm；柱温为25℃；流速1.0 mL/min。

2.2 色谱条件优化[5-8]

2.2.1色谱柱的选择

以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）为流动相，采用依利特Hypersil ODS-C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)柱号：E1523089；Kromasil 100-5 C18 (5 μm,250 mm×4.60 mm)E 34067；SHIMADZU VP-ODS C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)serial No.6122225三种色谱柱进行测定。

2.2.2流动相选择

对流动相甲醇-水（26:74）、甲醇-0.1%磷酸溶液（26:74）、乙腈-水（12:88）、乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）进行检测效果比较。

2.3 检测方法考察

2.3.1线性关系考察

精密吸取马钱苷对照品溶液（63.6 μg/mL）2 μL、5 μL、10 μL，马钱苷对照品溶液（0.212 mg/mL）5 μL、10 μL、15 μL,注入液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量（μg）为横坐标，得标准曲线。

2.3.2精密度考察

进样精密度：取同一份供试品溶液 （批号：071211），连续进样6次每次20 μL。

重复性：取本品（批号：071211），共6份，按2.1.4进样量20 μL。

2.3.3准确度（以回收率来标定）

采用加样回收试验，精密称取7份已知含量（批号：071211，每g含马钱苷0.831 mg）的耳聋左慈丸0.5 g，精密加入马钱苷对照品液（0.01696 mg/mL）的80%甲醇溶液 （取马钱苷对照品16.96 mg，置1000 mL量瓶，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，备用）各25 mL，按2.1.1项下制备，进样6次，进样量20 μL测定峰面积。

3 结果与分析

3.1 色谱条件优化结果

3.1.1色谱柱选择

色谱柱比较，采用不同厂家生产的C18色谱柱对同一份供试品溶液乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流动相进行测定，结果发现见表1。

表1 不同色谱柱分离效果的比较

主峰理论板数按马钱苷峰计算不低于5000，由表1明显看出Hypersil ODS C18柱要更好些。

3.1.2流动相选择

比较了甲醇-水（26:74）、甲醇-0.1%磷酸溶液（26:74）、乙腈-水（12:88）、乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88），结果以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流动相色谱峰形最好，故采用乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）为流动相。

3.2 方法考察结果

3.2.1线性关系

精密吸取马钱苷对照品溶液（63.6 μg/mL）2 μL、5 μL、10 μL，马钱苷对照品溶液（0.212 mg/mL）5 μL、10 μL、15 μL,注入液相色谱仪中，进样量与峰面积的比值见表2。

表2 标准曲线试验结果

由表2的数据可以得标准曲线：Y=1624.2X+24.219，R2=0.9994，表明马钱苷在0.1272～3.18 μg范围内，具有良好线性关系。

3.2.2精密度

取同一份供试品溶液（批号：071211），连续进样6次，按照色谱条件优化结果进行测定，测定结果表3。

表3 精密度试验结果

由表3可以发现，重复检测6次，马钱苷峰面积的RSD为0.4%(n=6)，RSD=0.4%，精密度良好。

重复性：取本品（批号：071211），共6份，按2.1. 1项下制备，按照色谱条件优化结果进行进行测定，结果见表4。

表4 重复性试验结果

由表4可以发现，重复检测6份，结果测得马钱苷平均含量为0.831 mg/g，RSD为0.5%，重现性良好。

3.2.3准确度（以回收率标定）

采用加样回收试验，精密称取7份已知含量（批号：071211，每克含马钱苷0.831 mg）的耳聋左慈丸0.5 g，精密加入马钱苷对照品液（0.01696 mg/mL）的80%甲醇溶液 （取马钱苷对照品16.96 mg，置1000 mL量瓶，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，备用）各25 mL，按2.1.1项下制备，按照色谱条件优化结果进行分析，按以下公式计算回收率，结果见表5。

表5 加样回收试验结果

由表5可以发现，重复检测6份，结果测得马钱苷平均回收率为99.65%，RSD为0.5%，准确度较好。

3.2.4稳定性

取同一份供试品溶液（批号：071211），间隔一定时间分别进样，按照色谱条件优化结果进行测定，测定结果见表6。

表6 稳定性试验结果

由表6的数据可以发现，在27 h内，间隔一定时间，检测7次，结果测得马钱苷峰面积的RSD为0.7%(n=7)，表明供试品在27 h内用该方法检测基本稳定。

4 总结

本研究建立了耳聋左慈丸中马钱苷的含量测定方法,并从专属性、重复性、准确度、耐用性及稳定性等方面进行考察。研究结果发现采用Agilent 1100液相仪，以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流动相柱温20℃，检测效果较好。利用该方法对杭州胡庆余堂药业有限公司提供的几批耳聋左慈丸中马钱苷含量进行测定，验证了该方法简便、快速,可作为耳聋左慈丸中马钱苷的含量测定方法。

[1]张振荣，刘新年，师允坤,等.耳聋左慈丸治疗神经性耳鸣、耳聋的临床观察[J].山东医药，1999，39（7）:63.

[2]李冠豪，何新芳，赖新生.针刺风市穴治疗神经性耳鸣耳聋[J].中国针灸，2006，26（6）:418.

[3]徐伟，刁复强.马钱苷对人体健康的潜在作用[J].国外医学卫生学分册,1998，25(2):81-84.

[4]国家药典委员会编.中华人民共和国药典2005版（一部）[M].北京：化学工业出版社,2005：245.

[5]杜小伟，范力力，王京辉,等.不同产地制山茱萸中马钱苷的含量测定[J].中国中药杂志，2006，31（17）:1446-1447.

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[7]水彩红,曹红.HPLC法测定山茱萸药材及六味地黄胶囊中马钱苷的含量[J].中国药品标准，2005,6(4):17-20.

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Determination of Loganin in Erlong Zuoci Pills by HPLC

LU Xuan,ZHANG Xing-hai,HUANG Xue-mei
（The Department of Applied Engineering,Zhejiang Economic and Trade Polytechnic,Hangzhou 310018,China）

Objective:To develop an HPLC method for determination of loganin in Erlong Zuoci pills（traditional Chinese medicine）.Methods:The analysis was established by the Agilent 1100 HPLC,the flow rate was 1.0 mL·min-1,column temperature was 20℃ and detection wavelength was set at 240 nm;screening test conditions of loganin from the column type,types of mobile phase;from the linear range,recovery,precision, reproducibility and stability and so on to conduct investigations.Results:The calibration curve for loganin was linear within the range of 0.1272～3.18 μg(r2=0.9994),precision injection well(RSD=0.4%,n=6),a good sample reproducibility(RSD=0.5%,n=6),sample stability well(RSD=0.5%,n=6)and the recovery(n=62)of ferulic acid was 99.6% (RSD=0.5%);the determination was performed on an Hypersil ODS-C18column (250mm×4.60 mm,5μm)with a mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid (V∶V=12∶88).Conclusions:The method is simple,accurate and reliable,specific,reproducible.

loganin;erlong zuoci pills;HPLC;quality analysis

1006-4184（2010）05-0029-03

2010-02-10

陆旋(1955-)，博士，从事生物资源利用研究。